食管癌組織中CtBP2與P16INK4A的表達(dá)及其相關(guān)性分析

食管癌組織中CtBP2與P16INK4A的表達(dá)及其相關(guān)性分析*

戴曉榮，成宏偉，李瑤瑤，周瑞

(揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬泰興市人民醫(yī)院，江蘇泰興225400)

摘要：目的：探討CtBP2與P16INK4A在食管癌組織中的表達(dá)，并且分析兩者之間的相關(guān)性。方法：使用免疫組化法(PV二步法)對我院90例食管癌患者組織中CtBP2與P16INK4A的表達(dá)進(jìn)行檢測，并使用統(tǒng)計(jì)軟件對兩者的相關(guān)性進(jìn)行分析。結(jié)果：在不同分期中，Ⅰ期和Ⅱ期患者食管癌組織中的P16INK4A陽性率為55.77%，Ⅲ期以上為18.42%，差異較為顯著(=7.176，P<0.05)；在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中，CtBP2陰性和陽性的差異比較大(=10.986，P<0.01)；P16INK4A與CtBP2呈現(xiàn)典型的負(fù)相關(guān)關(guān)系，r=-0.417，P<0.01。結(jié)論：CtBP2可以通過抑制細(xì)胞周期抑制因子P16INK4A來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞增殖，兩者對于細(xì)胞的調(diào)控是從相反的兩個(gè)方向進(jìn)行的。

關(guān)鍵詞：P16INK4A;CtBP2;食管癌組織

文章編號(hào)：1006-6233(2015)10-1663-04

基金項(xiàng)目：*江蘇省泰州市科技支撐項(xiàng)目，(編號(hào)：TS2013014)

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

食管癌是全球發(fā)病率和死亡率比較高的惡性腫瘤之一，其五年生存率小于30%。對于食管癌患者需要采用手術(shù)治療輔以放療等治療手段進(jìn)行治療，但其臨床效果及其預(yù)后仍然不是很理想。細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控因子P16INK4A的表達(dá)及修飾異常在食管癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用，但其在腫瘤中轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的具體機(jī)制還不明確。有研究表明在原代成纖維細(xì)胞中CtBP可以通過抑制P16INK4A轉(zhuǎn)錄而調(diào)控腫瘤的衰老和再生[1]。同時(shí)一些前期的研究發(fā)現(xiàn)，一種轉(zhuǎn)錄阻礙物CtBP2在食管癌組織中高表達(dá)，并且可能通過抑制P16的表達(dá)影響食管癌細(xì)胞的增殖和凋亡，從而提出了CtBP2對P16INK4A轉(zhuǎn)錄抑制的負(fù)性調(diào)節(jié)作用參與食管癌的發(fā)生及發(fā)展的假說[2]。本文中，試圖分析出CtBP2與P16INK4A在食管癌增殖的表達(dá)，并對其相關(guān)性進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)道如下：

1資料與方法

1.1研究對象:從2012年4月至2014年6月期間具有可行性的臨床病例標(biāo)本90例。其中，標(biāo)本采集均得到患者或家屬的知情同意。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有研究患者病例均通過術(shù)后病理學(xué)或者活檢被確診為食管癌，此前無食管癌相關(guān)放化療史。排除有任何其他腫瘤診斷史。90例食管癌患者，其中男性51例，女性39例，患者年齡區(qū)間介于38～69歲，平均年齡48歲。通過查閱病史和病歷記錄的方法獲得如下數(shù)據(jù)，病例組診斷年齡鱗癌69例，腺癌21例。臨床分期Ⅰ期14例，Ⅱ期38例，Ⅲ期38例，Ⅳ期0例。出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移70例，無20例?；颊咝g(shù)前均為接受放化療，且無其他全身系統(tǒng)性疾病，對患者進(jìn)行定期復(fù)查，并且有完整的隨訪資料記錄。

1.2藥品及儀器:藥品：甲醛溶液(化學(xué)純)，國藥集團(tuán)；無水乙醇(分析純)，國藥集團(tuán)；過氧化氫(化學(xué)純)，國藥集團(tuán)；EDTA緩沖液，自配；磷酸緩沖鹽溶液(PBS緩沖液)，自配。儀器：電熱恒溫水浴箱，上海啟前電子科技有限公司；微波爐，上海格蘭仕有限公司；免疫組化檢測系統(tǒng)，上海美軒生物科技有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法:P16INK4A以及CtBP2的檢測采用免疫組化法(PV二步法)[3]。采用半數(shù)計(jì)量法，200倍纖維鏡下選取8個(gè)視野，每個(gè)視野下選取200個(gè)計(jì)數(shù)細(xì)胞。細(xì)胞無顯色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。根據(jù)陽性細(xì)胞所占的比例數(shù)再按照其百分比進(jìn)行分類：陽性細(xì)胞所占百分比<10%的記為1分，10%～75%記為2分，>75%記為3分。上述兩項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)的評分相乘，1分以下為陰性，大于1分的為陽性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用Stata7.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對免疫組化結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2結(jié)果

2.1P16INK4A在食管癌組織中的表達(dá),見表1。

表1　P16 INK4A在食管癌組織中的表達(dá)

根據(jù)表1可以看出，P16INK4A在不同病理分型以及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移兩個(gè)方面的差異不是很顯著，值分別為0.453，0.986，P值均大于0.05。但是，在不同分期中差異較為顯著，Ⅰ期和Ⅱ期患者食管癌組織中的P16INK4A陽性率為55.77%，Ⅲ期以上為18.42%，P<0.05，差異較為顯著。

2.2CtBP2在食管癌組織中的表達(dá)，見表2。

表2　CtBP2在食管癌組織中的表達(dá)

根據(jù)表2可以發(fā)現(xiàn)，CtBP2在病理分型以及病理分期兩個(gè)方面的差異不顯著，P值均大于0.05；CtBP2在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移這個(gè)表中，陰性和陽性的差異比較大，值達(dá)到8.986，P<0.01。

2.3食管癌組織中P16INK4A與CtBP2的相關(guān)性分析，見表3。

表3　食管癌組織中P16 INK4A與CtBP2的相關(guān)性分析

根據(jù)表3可以發(fā)現(xiàn)，食管癌組織中，P16INK4A與CtBP2呈現(xiàn)典型的負(fù)相關(guān)關(guān)系，r=-0.417，P<0.01。

3討論

真核生物基因的調(diào)控機(jī)制是當(dāng)前分子生物學(xué)較為活躍的研究領(lǐng)域之一，而轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是一個(gè)基因發(fā)揮功能的復(fù)雜過程。轉(zhuǎn)錄因子因其存在的廣泛性和調(diào)控靶基因的多樣性，與腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、凋亡、浸潤轉(zhuǎn)移以及血管生成等各個(gè)環(huán)節(jié)密切相關(guān)。隨著對轉(zhuǎn)錄因子及其作用機(jī)制的深入研究，針對轉(zhuǎn)錄因子活化與抑制從不同環(huán)節(jié)尋找藥物作用的靶向治療以及預(yù)防與轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控相關(guān)的腫瘤疾病[4]，已成為當(dāng)今新的研究熱點(diǎn)，有望成為研究新型抗腫瘤藥物作用機(jī)制的有效途徑。

P16INK4A被認(rèn)為是一種調(diào)控細(xì)胞周期并抑制細(xì)胞分裂的重要基因，定位于人類第9號(hào)染色體短臂2區(qū)1帶(9p21)。P16INK4A是作用于細(xì)胞分裂周期關(guān)鍵酶之一的CDK4的抑制因子，對CDk4有高度親和性，與CDk4特異性結(jié)合后，能抑制CDk4激酶活性。P16INK4A的另一種功能是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。它在人類50%的腫瘤中失活，其中家族性黑色素瘤、膽管瘤與P16INK4A基因突變有關(guān)，P16INK4A基因位點(diǎn)的同源性確實(shí)常發(fā)生在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、間皮瘤、鼻咽瘤和急性淋巴細(xì)胞白血病，據(jù)報(bào)道許多其他惡性腫瘤也有P16INK4A的突變和缺失[5]。因此P16INK4A在細(xì)胞增殖、分化和凋亡等活動(dòng)中扮演重要角色。P16INK4A蛋白功能異常導(dǎo)致細(xì)胞周期的紊亂，促進(jìn)細(xì)胞的失控性生長或凋亡下降，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。研究證明在食管癌中P16INK4A是一個(gè)重要的臨床預(yù)后指標(biāo)，食管癌中P16INK4A與腫瘤的大小、分化程度、侵襲能力及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。大多數(shù)食管癌組織中P16INK4A呈低表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞周期失調(diào)，引發(fā)細(xì)胞過度增殖。

CtBP(C-terminal binding protein)最初是因?yàn)榕cE1A蛋白的C末端五個(gè)氨基酸結(jié)構(gòu)域(PLDLS)結(jié)合而命名，是進(jìn)化上保守的轉(zhuǎn)錄抑制因子，能與一些DNA活性蛋白特異性結(jié)合[6]，作為DNA結(jié)合蛋白與轉(zhuǎn)錄抑制酶之間的橋梁，進(jìn)而抑制基因轉(zhuǎn)錄。近年來研究表明CtBP可以通過抑制上皮型鈣黏蛋白E-cadherin表達(dá)而促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，也可以通過發(fā)揮轉(zhuǎn)錄輔阻遏物的作用負(fù)性調(diào)節(jié)一些腫瘤抑制因子從而產(chǎn)生致癌作用，所以CtBP也被認(rèn)為是一個(gè)抗凋亡因子。CtBP2被研究最多的功能是作為短距離的轉(zhuǎn)錄抑制物。一般認(rèn)為其是通過直接與能夠和DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子或連接蛋白相互作用進(jìn)而被募集至啟動(dòng)子來抑制基因的表達(dá)，然而其作用的具體機(jī)制還不清楚。

從本文成果來看，CtBP2作為一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，能夠成功抑制P16的活性，兩者呈現(xiàn)典型的負(fù)相關(guān)現(xiàn)象，并且P<0.01，很顯著。說明CtBP2可以通過抑制細(xì)胞周期抑制因子P16INK4A來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞增殖。它和P16INK4A對細(xì)胞周期的調(diào)控是從兩個(gè)相反的方向參與的。過高的CtBP2表達(dá)會(huì)嚴(yán)重影響P16INK4A啟動(dòng)子，對P16INK4A的表達(dá)產(chǎn)生下調(diào)作用，對P16INK4A的活性產(chǎn)生抑制。

參考文獻(xiàn)：

[1]Kovi RC, Paliwal S, Pande S, et al. An ARF/CtBP2 complex regulates BH3-only gene expression and p53-independent apoptosis[J].Cell Death Differ, 2010，(3):53～58.

[2]吳新民.CtBP2在大鼠創(chuàng)傷性損傷腦中的表達(dá)及意義[J].南通大學(xué)學(xué)報(bào)，2010,(2)：34～36.

[3]劉薇,王言奎,楊慧英,等.宮頸癌組織NDRG1與P16蛋白表達(dá)及其意義[J].齊魯醫(yī)學(xué)雜志,2012,27(4).309～313.

[4]Lee W, Swarup S, Chen J, et al. Homeodomain-interacting protein kinases (Hipks) promote Wnt/Wg signaling through stabilization of beta-catenin/Arm and stimulation of target gene expression[J].Development, 2009,(2)：24～27.

[5]Yuchan Wang, Fang Liu, Feng Mao.Interaction with Cyclin H/Cyclin-dependent Kinase 7 (CCNH/CDK7) Stabilizes C-terminal Binding Protein 2 (CtBP2) and Promotes Cancer Cell Migration[J].Biol Chem,2013,(3)：31～36.

[6]葉曉霞,石彥,霍克克,等.羧基末端結(jié)合蛋白CtBP2與泛素結(jié)合酶UBE2的相互作用[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2011,33(17).