熱處理對(duì)玉米象保護(hù)酶活性的影響

張會(huì)娜 呂建華 白旭光 劉淑麗

熱處理對(duì)玉米象保護(hù)酶活性的影響

張會(huì)娜 呂建華 白旭光 劉淑麗

（河南工業(yè)大學(xué)谷物資源轉(zhuǎn)化與利用省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450052）

分別以43、47、51、55℃對(duì)玉米象（SitophiLus zeamais）成蟲進(jìn)行熱處理，測(cè)定不同處理時(shí)間后其超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）的活性。在43、47℃的高溫處理?xiàng)l件下，保護(hù)酶活性存在應(yīng)激性升高的階段，最大值分別達(dá)到13.49 U／mgSOD、0.39 U／mgPOD、4.20 mgH2O2／（min·mg）CAT，酶活性顯著增強(qiáng)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)活性受到抑制。51、55℃高溫處理后，CAT活性均不高于對(duì)照水平，最低值僅為對(duì)照組的70%，SOD、POD活性在55℃處理不同時(shí)間后，明顯低于43、47、51℃處理后的酶活性。結(jié)果表明，玉米象成蟲體內(nèi)3種酶活性與高溫處理溫度、處理時(shí)間有一定的相關(guān)性，升高溫度和延長(zhǎng)高溫處理時(shí)間能導(dǎo)致保護(hù)酶活性降低。

熱處理 玉米象 SOD POD CAT

熱處理殺蟲是一種防治衛(wèi)生害蟲及檢疫害蟲的有效方法，具有致死時(shí)間短、不產(chǎn)生抗性、無(wú)化學(xué)殘留等優(yōu)點(diǎn)［1－2］。科學(xué)合理的熱處理不會(huì)損害糧食的品質(zhì)，并且對(duì)糧食的加工品質(zhì)具有一定改善作用［3－4］。目前熱處理已初步應(yīng)用于檢疫害蟲和衛(wèi)生害蟲的防治，在防治儲(chǔ)藏物害蟲方面也有一定的研究與應(yīng)用［5］。在北美，熱處理已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品廠、面粉加工廠的害蟲除治，并得到美國(guó)環(huán)保局（EPA）、食品藥品監(jiān)督局（FDA）的充分認(rèn)可。當(dāng)前對(duì)于熱處理殺蟲的研究報(bào)道主要集中于處理?xiàng)l件、處理效果等，而對(duì)于熱處理后害蟲的生理生化變化研究較少［6］。

昆蟲體內(nèi)存在多種抗氧化酶，據(jù)報(bào)道［7－9］，SOD、POD、CAT 3種酶組成保護(hù)酶系統(tǒng)，能保證機(jī)體自由基代謝正常，維持昆蟲體內(nèi)的生理活動(dòng)正常進(jìn)行。對(duì)昆蟲進(jìn)行熱處理后，能引起昆蟲體內(nèi)的保護(hù)酶系統(tǒng)調(diào)控機(jī)制的應(yīng)答，在一定程度上保證昆蟲體內(nèi)的生理活動(dòng)正常進(jìn)行。因此，昆蟲體內(nèi)保護(hù)酶活性的變化可以作為昆蟲熱處理?xiàng)l件選擇的重要指標(biāo)。

玉米象（S．zeamais）是全世界重要的儲(chǔ)藏物害蟲，而目前對(duì)玉米象的防治主要依靠化學(xué)防治方法。受害蟲抗藥性的增加、有效熏蒸劑減少等因素的影響，化學(xué)防治的效果面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。此外，環(huán)境保護(hù)理念的產(chǎn)生、綠色儲(chǔ)糧技術(shù)的應(yīng)用也對(duì)儲(chǔ)藏物害蟲的防治方法提出新的要求［10］。因此，熱處理作為一種非化學(xué)防治方法，在替代化學(xué)防治方面具有較為廣闊的應(yīng)用前景。目前，關(guān)于儲(chǔ)藏物害蟲在熱處理后，害蟲機(jī)體的保護(hù)酶調(diào)控機(jī)制還鮮有報(bào)道。本研究利用實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的玉米象成蟲測(cè)定在不同的熱處理?xiàng)l件下，試蟲體內(nèi)的保護(hù)酶活性變化，研究試蟲體內(nèi)保護(hù)酶系統(tǒng)對(duì)高溫的應(yīng)答，以期為科學(xué)合理實(shí)施熱處理殺蟲提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

供試?yán)ハx為河南工業(yè)大學(xué)儲(chǔ)藏物昆蟲實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的玉米象，在溫度（28±1）℃、相對(duì)濕度（75±5）%的條件下以整粒小麥飼養(yǎng)，小麥?zhǔn)褂们胺湃牒嫦洌?0℃）中消毒2 h，調(diào)節(jié)含水量至（13±1）%，取羽化后1～2周的成蟲供試。

1.2 試驗(yàn)處理

將玻璃瓶（直徑4 cm，高9.5 cm）置于恒溫水浴鍋中（保證水浸沒(méi)瓶身高度8 cm），將溫濕度計(jì)探頭置于玻璃瓶中心以測(cè)瓶?jī)?nèi)溫度，待達(dá)到設(shè)定溫度并穩(wěn)定后快速接入20頭羽化后1～2周的玉米象成蟲（不分雌雄），用脫脂棉封口減少瓶?jī)?nèi)溫濕度與外界的傳遞。高溫處理?xiàng)l件設(shè)定為：43℃處理時(shí)間分別為165、205、245、285、325、365、405、445 min；47 ℃處理時(shí)間分別為10、20、30、40、50、60、70 和80 min；51 ℃處理時(shí)間分別為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5 min；55 ℃ 處理時(shí)間分別為40、50、60、70、80、90、100、110 s。將試蟲在不同處理溫度下處理不同時(shí)間后快速取出，并在液氮中研磨制備酶液，重復(fù)3次。

1.3 酶活性測(cè)定

1.3.1 酶液的制備

參照李周直等［8］的方法并加以改進(jìn)。取經(jīng)過(guò)高溫處理的玉米象成蟲20頭，用PH 7.2的Tris－HCl緩沖液（內(nèi)含1%的聚乙烯吡咯烷酮和1%的EDTA）清洗干凈，液氮研磨，將研磨液轉(zhuǎn)入2.0 mL預(yù)冷的離心管中，用Tris－HCl緩沖液沖洗研缽后并入研磨液中，用緩沖液補(bǔ)充至2.0 mL，于0～4℃以11 000 r／min離心20 min，取上清液作為提取酶液，儲(chǔ)存于4℃冰箱中。

1.3.2 蛋白質(zhì)的測(cè)定

參照Bradford［11］的考馬斯亮藍(lán)G－250方法測(cè)定酶液中蛋白質(zhì)含量（以mg／mL表示）。

1.3.3 酶活性測(cè)定

SOD活性的測(cè)定參考馬志卿等［12］的鄰苯三酚法?？偡磻?yīng)體系為2.2 mL H2O、25μL鄰苯三酚、2.25 mL PH 8.2的Tris－HCl緩沖液（含1%聚乙烯吡咯烷酮和1%的EDTA），50μL酶液，于波長(zhǎng)為420 nm測(cè)定吸光度值，按公式計(jì)算SOD的活性。

SOD 活性（OD420／mg）＝ （OD1－ OD2）／（OD1×0.5×蛋白質(zhì)含量）

式中：OD1為鄰苯三酚2 min吸光度；OD2為樣品所測(cè)吸光度。1個(gè)酶活單位（U）相當(dāng)于4.525 mL反應(yīng)液達(dá)到50%的抑制所需的酶量，酶活性以U／mg表示。

POD活性的測(cè)定參考Simon等［13］的愈創(chuàng)木酚法。反應(yīng)混合液為2.0 mL PH 4.0的醋酸緩沖液、50 μL酶液、1.0 mL 0.05 mol／L 愈創(chuàng)木酚、1.0 mL 0.3 mol／L的H2O2，加入試管立即搖勻并迅速倒入比色皿中，于470 nm波長(zhǎng)下比色，以蒸餾水調(diào)零，以緩沖液代替酶液作對(duì)照，記錄4 min后的吸光度值，酶活性以U／mg表示。

POD 活性（U／mg）＝OD1／t／蛋白質(zhì)含量

式中：OD1為混合液470 nm的吸光度；t為反應(yīng)時(shí)間／min。

CAT活性的測(cè)定參考楊蘭芳等［14］的標(biāo)準(zhǔn)曲線法。取A、B 2支試管，A為對(duì)照管，B為樣品管。在A中按順序加入1.5 mL PH 7.8 Tris－HCl緩沖溶液（內(nèi)含1%的聚乙烯吡咯烷酮和1%的EDTA）、0.1 mL 酶液、1.4 mL H2O、1.0 mL 8%H2SO4。B管里依次加1.5 mL Tris－HCl緩沖溶液、0.1 mL酶液、1.1 mL H2O，0.3 mL 0.3mol／L 的H2O2，搖勻，反應(yīng)3 min后加入1.0 mL 8%H2SO4終止反應(yīng)。用A管調(diào)零，在波長(zhǎng)為240 nm處測(cè)定樣品管的吸光度，酶活性以每分鐘每毫克蛋白質(zhì)消耗H2O2毫克數(shù)計(jì)。

式中：A2為對(duì)照的吸光度；A1為樣品的吸光度；t為反應(yīng)時(shí)間／min；a、b為標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程中的常數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010、SAS 9.0軟件進(jìn)行方差分析，采用Duncan's新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較，檢驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果的可信度以及各處理間差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 43℃高溫處理對(duì)玉米象酶活性的影響

43℃高溫處理對(duì)玉米象保護(hù)酶活性的影響如表1所示。由表1可知，在整個(gè)高溫處理過(guò)程中，隨著高溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD活性升高后降低，POD活性逐漸降低，CAT活性則呈現(xiàn)降低－升高－降低的趨勢(shì)。SOD、POD活性在高溫處理時(shí)間不高于245 min時(shí)變化不大，方差分析表明酶活性無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。在高溫處理時(shí)間為285 min時(shí)SOD活性在達(dá)到峰值，約是對(duì)照組的1.16倍，POD和CAT活性則在325 min時(shí)達(dá)到最大，但與對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P＞0.05），之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)3種保護(hù)酶活性降低，表現(xiàn)為抑制作用。

表1 43℃高溫處理對(duì)玉米象體內(nèi)保護(hù)酶活性的影響

2.2 47℃高溫處理對(duì)玉米象酶活性的影響

由表2可以看出，在47℃高溫處理?xiàng)l件下，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，玉米象的POD、CAT活性呈現(xiàn)先下降又上升再下降的趨勢(shì)，SOD活性則隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)升高后降低。SOD活性達(dá)到峰值的時(shí)間較43℃處理時(shí)短，在處理時(shí)間為20 min時(shí)即達(dá)到了13.49 U／mg，活性在短時(shí)間內(nèi)得到了增強(qiáng)，且整個(gè)處理過(guò)程中活性都比對(duì)照組高。POD活性在高溫處理時(shí)間為80 min時(shí)被明顯抑制，與對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05）。CAT活性在處理時(shí)間為60 min時(shí)顯著增強(qiáng)，活性值高出對(duì)照組0.39 mgH2O2／（min·mg），表明適當(dāng)提高處理時(shí)間對(duì)CAT活性起激活作用。

表2 47℃高溫處理對(duì)玉米象體內(nèi)保護(hù)酶活性的影響

2.3 51℃高溫處理對(duì)玉米象酶活性的影響

玉米象經(jīng)51℃高溫處理后，隨著高溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD、POD活性先升高后降低，CAT活性逐漸下降。SOD在整個(gè)處理時(shí)間段活性均高于對(duì)照組，但只有處理時(shí)間為3、3.5 min時(shí)的活性與對(duì)照存在顯著性差異（P＜0.05）。POD活性在2.5、3 min時(shí)達(dá)到峰值，之后隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)活性逐漸被抑制。51℃高溫短時(shí)處理對(duì)CAT活性影響較小，表現(xiàn)為處理時(shí)間不大于5 min時(shí)，不同處理時(shí)間之間酶活性無(wú)顯著性差異（P＞0.05），在高溫處理時(shí)間為5.5 min時(shí)CAT活性顯著下降，表現(xiàn)為抑制作用。

表3 51℃高溫處理對(duì)玉米象體內(nèi)保護(hù)酶活性

2.4 55℃高溫處理對(duì)玉米象酶活性的影響

在55℃高溫處理?xiàng)l件下，玉米象體內(nèi)SOD活性隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而上升，POD和CAT活性則隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)先下降后又上升。SOD在處理時(shí)間低于70 s時(shí)、POD和CAT在整個(gè)處理時(shí)間段內(nèi)，其活性均低于對(duì)照組，表現(xiàn)為抑制作用。POD和CAT活性分別在處理時(shí)間為60、70 s時(shí)到達(dá)最低值，分別為0.25 U／mg 和2.64 mgH2O2／（min·mg），顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。

表4 55℃高溫處理對(duì)玉米象體內(nèi)保護(hù)酶活性

3 討論與結(jié)論

昆蟲處于逆境環(huán)境，體內(nèi)活性氧增加，而SOD、POD和CAT這3種酶組成的防御系統(tǒng)能維持自由基代謝的穩(wěn)定［15］。因此，保護(hù)酶活性的大小可以影響昆蟲的耐受高溫脅迫的能力。

玉米象的保護(hù)酶活性與處理的溫度、時(shí)間有一定的相關(guān)性。溫度是影響SOD活性的重要因素，適度升高溫度能增加SOD的活性，但溫度過(guò)高則產(chǎn)生抑制作用。55℃高溫處理不同時(shí)間后，POD和CAT活性受到抑制。溫度相同時(shí)，保護(hù)酶活性受處理時(shí)間的影響顯著，整體上保護(hù)酶活性在高溫處理的最后階段均顯著降低。由研究結(jié)果可知，提高處理溫度或延長(zhǎng)處理時(shí)間能抑制保護(hù)酶活性，55℃高溫處理玉米象能使保護(hù)酶活性在短時(shí)間內(nèi)降低，可作為快速致死害蟲的有效溫度。

昆蟲體內(nèi)除SOD、CAT和POD組成的保護(hù)酶系統(tǒng)維持的自由基代謝平衡外，還有谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GSH），多功能氧化酶（MFO）等，這些自由基代謝酶系在熱處理時(shí)對(duì)昆蟲生理生化的調(diào)控作用，則有待進(jìn)一步研究［16－18］。

［1］ISPM—2009，International standards for phytosanitary measures［S］

［2］白旭光.儲(chǔ)藏物害蟲與防治［M］.第二版.北京：科學(xué)出版社，2002

Bai X G.The pests and prevention of storage［M］.The second edition.Bei Jing：Science Press，2002

［3］張習(xí)軍，熊善柏，趙思明.微波處理對(duì)稻谷品質(zhì)的影響［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42（1）：224 －229

Zhang X J，Xiong SB，Zhao SM.Effect of microwave on paddy quality［J］.Scientia Agricultura Sinca，2009，42（1）：224 －229

［4］朱邦雄，鄧樹(shù)華，周劍宇，等.熱處理控制稻米害蟲危害的研究［J］.糧食儲(chǔ)藏，2009，38（6）：10 －13

Zhu B X，Deng SH，Zhou JX，et al.Stored grain pests control by heat treatment［J］.Grain Storage，2009，38（6）：10 －13

［5］Tang J.Heat treatments for postharvest pest control：theory and practice［M］.2007

［6］Du Y，Ma C，hao Q，et al.Effects of heat stress on physiological and biochemical mechanisms of insects：a literature review［J］.Acta Ecologica Sinica，2007，27（4）：1565 －1572

［7］Fridovich I.Oxygen is toxic［J］.Bioscience，1977，27（7）：462－466

［8］李周直，沈惠娟，蔣巧根，等.幾種昆蟲體內(nèi)保護(hù)酶系統(tǒng)活力的研究［J］.昆蟲學(xué)報(bào)，1994，37（4）：399 －403

Li Z Z，Shen H J，Jiang QG，et al.A study on the activities of endogenous enzymes of protective system in some insects［J］.Acta Entomologica Sinica，1994，37（4）：399 －403

［9］杜堯，馬春森，趙清華，等.高溫對(duì)昆蟲影響的生理生化作用機(jī)理研究進(jìn)展［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2007，27（4）：1565 －1571

Du Y，Ma CS，Zhao Q H，et al.Effects of heat stress on physiological and biochemical mechanisms of insects：a literature review［J］.Acta Ecologica sinica，2007，27（4）：1565 －1571

［10］程小麗，武傳欣，劉俊明，等.儲(chǔ)糧害蟲防治研究進(jìn)展［J］.糧油倉(cāng)儲(chǔ)科技通訊，2010（6）：26 －29

Cheng X L，Wu C X，Liu J M，et al.Study of different ways to prevent insect pests of stored grain［J］.Liangyou Cangchu Keji Tongxun，2010（6）：26 －29

［11］Bradford M M.A rapid sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein－dye binding［J］.Anal.Biochem，1976（72）：255 －260

［12］馬志卿，顏瑞莉，陳根強(qiáng)，等.松油烯－4－醇對(duì)粘蟲體內(nèi)保護(hù)酶活力的影響［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2004，32（10）：85 －88

Ma Z Q，Yan R L，Chen G Q，et al.Effect of terpinen －4 －ol on the activities of endogenous enzymes of protectives system in armyworm（Mythimna Separate Walker）［J］.Jour.of Northwest Sci－ Tech Univ.of Agri and For.（Nat.Sci.Ed.），2004，32（10）：85 －88

［13］Simon L，F(xiàn)atrai Z，Jonas D，et al.Study of peroxide metabolism enzymes during the development of Phaseolus vulgaris［J］.Biochem Physiol Pflanz BPP，1974：387 －392

［14］楊蘭芳，龐靜，彭小蘭，等.紫外分光光度法測(cè)定植物過(guò)氧化氫酶活性［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2009（20）：364－366

Yang L F，Pang J，Peng X L，et al.Measurement of catalase activity in plants by ultraviolet spectrophotometry［J］.Modern agricultural science and technology，2009，20：364 －366

［15］劉纏民，馬捷瓊.溫度對(duì)大黑蟻存活率及其保護(hù)酶系影響的相關(guān)分析［J］.四川動(dòng)物，2007，25（4）：796 －797

Liu C M，Ma J Q.Correlation analysis between survival rate and protection enzymes ofpolyrhachis vicina under different temperatures［J］.Sichuan Journal of Zoology，2007，25（4）：796－797

［16］馮紀(jì)年，田宏剛，郭付振，等.昆蟲細(xì)胞色素P450研究進(jìn)展［J］.當(dāng)代昆蟲學(xué)研究——中國(guó)昆蟲學(xué)會(huì)成立60周年紀(jì)念大會(huì)暨學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集，2004：200－206

Feng J N，Tian H G，Guo F Z，et al.Review on cytochrome P450 of insect［J］.Contemporary entomological research －the Vol.in 60thanniversary of Chinese society of insect and academic seminar，2004：200 －206

［17］張永國(guó)，亢晉勇.谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶的生理功能述評(píng)［J］.忻州師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2006（22）：125 －128

Zhang Y G，Kang JY.A review of physiological roles of Glutathione S － Transferases［J］.Journal of Xizhou Teachers U-niversity，2006，22：125 －128

［18］豆威，王進(jìn)軍.昆蟲谷胱甘肽S－轉(zhuǎn)移酶研究進(jìn)展［J］.農(nóng)業(yè)生物災(zāi)害預(yù)防與控制研究，2005：426－431

Dou W，Wang JJ.Review on insect GlutathioneS－Transferases［J］.Prevention and Control of Agricultural Biological，2005：426 －431.

Effect of Heat Treatment on the Activities of Protective Enzymes in Sitophilus Zeamais

Zhang Huina Lü Jianhua Bai Xuguang Liu Shuli
（School of Food Science and Technology，Henan University of Technology，Zhengzhou 450052）

The adults of Sitophilus zeamais were treated for a series of times in laboratory under 43，47，51 ℃and 55 ℃ respectively.The activities of superoxide dismutase（SOD），peroxidase（POD）and catalase（CAT）in S．zeamais adults were determined after heat treatment.Irritability increase stage was observed in activities of protective enzymes when high temperature treatment under 43，47 ℃，with the maximum value being 13.49 U／mg（SOD），0.39 U／mg（POD），4.20 mg H2O2／（min·mg）（CAT）respectively.The activities of enzymes were enhanced significantly and then restricted with the extension of time.The activity of CAT was lower than the control after high temperature under 51，55 ℃，the lowest was only 70%of that in the control.The activities of SOD and POD were lower than that in 43，47，51 ℃ after high temperature under 51，55 ℃.Analysis showed that the activities of three protective enzymes of S．zeamais adults had a certain relationship with the treatment temperatures and treatment times.Improving temperature and prolonging heat treatment time could result in lower activity of protective enzyme.

heat treatment，Sitophilus zeamais，SOD，POD，CAT

TQ646

A

1003－0174（2016）08－0090－05

863計(jì)劃（2012AA101705－2），河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究（152300410078），谷物資源轉(zhuǎn)化與利用省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題（001255）

2014－12－11

張會(huì)娜，女，1989年出生，碩士，儲(chǔ)糧害蟲綜合治理與安全儲(chǔ)糧技術(shù)

呂建華，男，1971年出生，副教授，儲(chǔ)糧害蟲綜合治理與安全儲(chǔ)糧技術(shù)