植物病毒載體研究及應(yīng)用進(jìn)展

王強(qiáng)++彭日民++朱品++竺錫武

摘要 該文概述了植物病毒載體的類型，應(yīng)用病毒載體表達(dá)外源蛋白，分析和利用基因功能方面的進(jìn)展。

關(guān)鍵詞 病毒載體；外源蛋白；基因功能

中圖分類號(hào) S476+.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2015）20-0086-03

Advancement on Research and Application of Plant Virus Vectors

WANG Qiang 1 PENG Ri-min 1 ZHU Pin 2 ZHU Xi-wu 1，2 *

（1 Institute of Agricultural and Biological Technology，Hunan University of Humanities，Loudi Hunan 417000； 2 Institute of Biological Engineering，Zhejiang University of Technology）

Abstract This paper outlined the types of plant virus vector and the process of applying viral vector to express foreign proteins，as well as analyze and utilize gene functions.

Key words virus vector；foreign protein；gene functions

基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程中的核心。病毒載體是基因表達(dá)載體的類型之一，是利用病毒的基因組序列元件構(gòu)建的真核基因轉(zhuǎn)錄工具，其目的是將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞并可以表達(dá)。病毒載體與基因遺傳轉(zhuǎn)化相比，病毒載體表達(dá)水平高，表達(dá)量可達(dá)基因遺傳轉(zhuǎn)化的100多倍[1]；試驗(yàn)快速，從載體的構(gòu)建到植物的表達(dá)周期短；植物病毒寄主多，且一般都有很強(qiáng)的侵染能力和一定的寄主范圍，可對(duì)一種寄主植物的多個(gè)品種或多個(gè)寄主接種，大大方便用于分析不同種植物的基因功能或在不同種植物或不同品種中表達(dá)外源蛋白。病毒載體作為一門新興的技術(shù)快速發(fā)展，國內(nèi)外的科學(xué)工作者也在進(jìn)一步開發(fā)并探析它的機(jī)理，并不斷拓寬應(yīng)用范圍，以提升病毒載體的潛在價(jià)值。目前已經(jīng)構(gòu)建了多種病毒載體運(yùn)用于植物分子生物學(xué)領(lǐng)域。下面僅就植物病毒載體的類型以及在外源蛋白表達(dá)、基因沉默、基因功能研究及其他領(lǐng)域應(yīng)用方面的概況作一綜述。

1 病毒載體的類型

根據(jù)植物病毒載體構(gòu)建時(shí)病毒基因組的結(jié)構(gòu)變化特點(diǎn)，可分為置換型、插入型、互補(bǔ)型病毒載體[2]。置換型載體主要是將病毒基因組中的某個(gè)基因的ORF框序列與外來基因ORF序列置換。早期置換型載體中被置換的病毒基因多為CP基因。最早的置換型病毒載體誕生于20世紀(jì)80年代，1984年，加拿大蒙特利爾大學(xué)的Brisson[3]等人，用DHFR基因替換掉了CaMV（花椰菜花葉病毒）的ORF II（蚜傳因子）基因，成功表達(dá)了細(xì)菌二氫葉酸還原酶基因（DHFR），并且對(duì)于病毒的系統(tǒng)性侵染沒有影響。而當(dāng)插入更大外源基因時(shí)，會(huì)出現(xiàn)片段的丟失，經(jīng)研究表明CaMV可插入片段的上限為250 bp[4]。近幾年來開發(fā)出將一個(gè)外源基因序列置換多個(gè)病毒基因序列的載體，如Tobacoo mosaic virus（TMV）的TRBO載體[5]。由于病毒基因組序列中有一部分被置換，置換型病毒載體將改變病毒本身已有的部分功能，如病毒復(fù)制量、病毒可移動(dòng)能力等，從而影響外源基因表達(dá)量。

插入型載體的構(gòu)建主要是將外源基因序列插入病毒基因組的非編碼區(qū)，或者將外源基因編碼序列與復(fù)制酶基因以外的其他基因（如CP基因）同框融合而實(shí)現(xiàn)在病毒基因組編碼區(qū)插入外源基因，從而實(shí)現(xiàn)外來基因表達(dá)等功能。在球面或二十面體病毒中，由于其病毒粒子的形態(tài)特征，導(dǎo)致不能插入較大的外源片段，但是在諸如TMV、PVY、ZYMV等桿狀病毒中，有研究報(bào)道可插入片段的上限為1.8 kb[6]。Shivprasad[7]等利用重復(fù)病毒外殼蛋白亞基因組啟動(dòng)子的方法，成功在煙草中表達(dá)了綠色熒光蛋白，并且病毒載體穩(wěn)定繁殖，不會(huì)出現(xiàn)丟失的現(xiàn)象。他在TMV U1株系中插入了TMGMV U5株系的CP亞基因組啟動(dòng)子，而其他病毒株系的啟動(dòng)子序列因?yàn)橥葱院芨撸汲霈F(xiàn)了基因重組，造成片段丟失的現(xiàn)象。

互補(bǔ)型病毒載體是將外源基因插入缺陷型病毒或用外源基因置換病毒的某個(gè)基因構(gòu)建而成，利用轉(zhuǎn)基因植株或輔助病毒補(bǔ)充提供失活基因產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)病毒的復(fù)制和擴(kuò)散。這種載體有安全的優(yōu)點(diǎn)，但也有載體不穩(wěn)定的問題[8]。

根據(jù)病毒載體接種植物后病毒在植物中是否可移動(dòng)可將病毒載體分為可移動(dòng)載體和不可移動(dòng)載體2大類。可移動(dòng)載體即改造后的病毒在植物接種葉中形成病毒粒子后，可長距離移動(dòng)至植物的其他葉等部位。不可移動(dòng)載體即改造后的病毒載體只能在植物接種葉中形成病毒并繁殖，不能長距離移動(dòng)至植物的其他部位。早期開發(fā)的病毒載體均為可移動(dòng)載體，如Potato virus X（PVX）的PVX載體[9]、Tobacco rattle virus（TRV）的TRV載體[10]、Tobacoo mosaic virus（TMV）的TMV載體[11]。近年來為了提高葉片中目的外源蛋白表達(dá)量，也為了減少病毒擴(kuò)散可能引起它種寄主植物致病等生物安全問題，許多學(xué)者開發(fā)了不可移動(dòng)的病毒載體，這些不可移動(dòng)的病毒載體同時(shí)也不對(duì)寄主植物產(chǎn)生致病癥狀，如TMV的TRBO載體[5]、Foxtail mosaic virus（FoMV）的FECT/40載體[12]、Cucumber mosaic virus（CMV）的C2-H1載體即CMV-no2b載體[13]。

2 病毒載體用于外源蛋白表達(dá)的研究

病毒載體構(gòu)建的早期目的主要用于外源蛋白表達(dá)。利用植物病毒載體表達(dá)外源基因的方法主要有2種：一是在體外轉(zhuǎn)錄攜帶目的基因的侵染性cDNA克隆，將病毒基因組cDNA進(jìn)行基因取代、插入融合等[14]，外源基因被加入后，便置于原核啟動(dòng)子下游，然后以其轉(zhuǎn)錄物RNA直接侵染植物或者用基因槍的方法將病毒載體轉(zhuǎn)入植物中完成侵染，接種植物后病毒在寄主細(xì)胞內(nèi)自主增殖進(jìn)行外源基因的表達(dá)[15]；二是將侵染性病毒的基因組cDNA克隆插入到Act2、CaMV35S轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子等下游構(gòu)建攜帶目的基因的侵染性重組病毒體，采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法侵染植物，從而在寄主細(xì)胞內(nèi)完成一系列轉(zhuǎn)錄、合成及裝配過程，實(shí)現(xiàn)外源基因的表達(dá)過程。Marillonnet等在前人的基礎(chǔ)上建立了農(nóng)桿菌滲透（Agro-infiltration）接種技術(shù)，便使得病毒載體用于外源蛋白表達(dá)達(dá)到了一個(gè)令人滿意的水平，使外源蛋白的表達(dá)又踏上了一個(gè)新臺(tái)階[16]。endprint

至今用于表達(dá)藥用蛋白的主要病毒載體及表達(dá)的藥用蛋白或抗原如下[13，17-18]：豇豆花葉病毒（cowpea mosaic virus，CPMV）表達(dá)的口蹄疫病毒（FMDV）VP1抗原、人免疫缺陷病毒（HIV-1）gp41抗原、人鼻病毒（HRV-14）抗原、犬細(xì)小病毒（CPV）抗原、慢性肺炎病菌（Pseudom aeruginosa）外層臘蛋白F抗原、stahylococcus aureus D2 domain肽、瘧疾抗原、水貂腸炎病毒（MEV）抗原、對(duì)傳染性腸胃炎病毒（TGEV）具有特異性小分子免疫蛋白（SIP）、乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）。TMV載體表達(dá)的有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（ACEI）、流感病毒血凝素、人免疫缺損病毒（HIV-1）抗原、瘧疾抗原、鼠帶狀瘡疹ZP3糖蛋白、口蹄疫病毒（FMDV）VP1抗原、α-天花粉蛋白、38C13鼠B細(xì)胞淋巴瘤單鏈抗體、腸癌病毒單抗、口蹄疫病毒（FMDV）VP1、牛孢疹病毒I型（BHV-1）gDC、豬傳染性腹瀉病毒（PEDV）中和表位；TBSV表達(dá)的人免疫缺損病毒（HIV-1）V3環(huán)抗原、犬細(xì)小病毒（CPV）抗原；PVX載體表達(dá)的有人免疫缺損病毒（HIV-1）gp41抗原、輪狀病毒VP6抗原、人類乳突病毒16（HPV-16）E7蛋白抗原、人乳鐵蛋白N葉、人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落剌激因子（GM-CSF）、肺結(jié)核抗原ESAT-6；ALMV載體表達(dá)的有呼吸道合胞病毒（RSV）G蛋白抗原；PPV病毒載體表達(dá)的兔出血熱病毒（RHDV）VP60抗原；三葉草黃脈病毒Clover yellow vein virus（ClYVV）載體表達(dá)可溶性甲烷單加氧酶C亞單位（sMMO-C）；CMV載體表達(dá)的aFGF蛋白等。

3 病毒載體用于分析或利用外源基因功能

植物病毒載體除了用于表達(dá)疫苗抗原、抗體和藥用蛋白生產(chǎn)外，還可用于表達(dá)外源基因，分析基因功能，分析外源蛋白與植物中蛋白質(zhì)的相互作用。例如，含番茄葉霉病菌avr9無毒基因的PVX重組表達(dá)載體通過農(nóng)桿菌浸潤接種帶有抗?。≧）基因cf-9的番茄植株葉，番茄植株會(huì)發(fā)生過敏反應(yīng)，表明R基因表達(dá)的產(chǎn)物可與avr9基因產(chǎn)物發(fā)生了直接的相互作用[19]。

植物病毒載體也可用于植物利用外源基因的功能。Shen等[20]將抗除草劑草丁膦的基因Bar插入到雙生病毒玉米線條病毒（MSV）中，再利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法來侵染玉米，就能在轉(zhuǎn)基因玉米植株表達(dá)而出現(xiàn)抗除草劑的性狀。但該病毒載體接種后仍保持原病毒的特性，對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米植株依然產(chǎn)生致病性，因此尚不能用于生產(chǎn)實(shí)際中。

4 病毒載體用于分析被沉默基因的功能

病毒介導(dǎo)的基因沉默（VIGS）是根據(jù)植物對(duì)RNA病毒獨(dú)特的防御機(jī)制發(fā)展而來的一種技術(shù)，因其操作簡便、效率高、周期短、避免植物轉(zhuǎn)化、克服基因重復(fù)等特點(diǎn)，可以在不同的遺傳背景下工作，對(duì)基因的分析更清楚，漸漸成為了研究植物基因功能的一種有效方法。在正向遺傳學(xué)及反向遺傳學(xué)發(fā)現(xiàn)和鑒定基因功能的研究方面發(fā)揮著重要作用，越來越多的植物病毒被改造成有效的沉默載體，在植物生長發(fā)育、抗逆、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能研究方面取得了顯著的進(jìn)展[21]。1997年，Van Kammen等[22]最早對(duì)VIGS進(jìn)行了定義，最初的意義是用來描述植物受病毒侵染后產(chǎn)生的癥狀恢復(fù)現(xiàn)象。后來，VIGS專指利用重組病毒載體攜帶外源基因侵染植物后，隨著病毒的復(fù)制和移動(dòng)特異性的誘導(dǎo)植物沉默自身內(nèi)源基因的一種現(xiàn)象[23-24]。1995年，Kumagai[25]等人，以煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）為載體進(jìn)行改造，他在TMV中插入了一段從煙草cDNA反轉(zhuǎn)錄出來的（phytoene desaturase，PDS）序列，利用這個(gè)攜帶PDS序列的病毒載體侵染煙草后，植物出現(xiàn)系統(tǒng)性褪綠的光漂白現(xiàn)象，同時(shí)PDS的mRNA水平也出現(xiàn)顯著性降低。結(jié)果說明植物出現(xiàn)漂白現(xiàn)象是由于PDS表達(dá)水平下降導(dǎo)致的，而PDS是類胡蘿卜素合成過程中的關(guān)鍵酶，對(duì)植物有著光保護(hù)作用。1998年，Ruiz等[26]采用PVX馬鈴薯X病毒（Potato X virus）載體攜帶PDS的序列的方法，也引發(fā)植物出現(xiàn)了相同的光漂白現(xiàn)象。后來，人們利用改造的VIGS載體對(duì)植物進(jìn)行目的性的基因沉默，抑制內(nèi)源基因的表達(dá)，從而達(dá)到研究植物基因功能的作用。1998年，Kjemtrup等[27]利用雙生病毒科的番茄金色花葉病毒（STMV）為VIGS載體插入鎂離子螯合酶（magnesium chelatase）的關(guān)鍵基Su（Sulfur）和轉(zhuǎn)熒光蛋白基因luc（lucif-erase），從而引起了植物出現(xiàn)葉片黃化和轉(zhuǎn)luc植物不再發(fā)出熒光的表型。2001年，Ratcliff等[28]，報(bào)道了以煙草脆裂病毒 TRV構(gòu)建的VIGS載體，相比于PVX、TMV、TGMV有許多優(yōu)點(diǎn)，其中TRV的 VIGS 載體相比于PVX對(duì)植物的癥狀影響較輕，并且在沉默效率、侵染范圍、持久性方面都比PVX更加完善。2002年，Liu等[29]利用煙草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）在番茄中進(jìn)行了VIGS試驗(yàn)，可以對(duì)已經(jīng)公布的番茄 EST文庫進(jìn)行功能研究分析。目前，TRV是應(yīng)用范圍最廣的VIGS病毒載體，不僅其誘導(dǎo)植物的沉默效率高，而且更容易誘導(dǎo)分生組織的基因沉默，目前在煙草、番茄等茄科植物中均有大量的報(bào)道。TRV載體目前有3個(gè)版本，最初由Ratcliff等[30]構(gòu)建的版本，Liu等[31]的pYL156、pYL279修改版本以及 Valentine等[32]構(gòu)建的 TRV-2b版本。其中，Liu等[31]的 pYL156和pYL279版本，為了使病毒在植株內(nèi)大量擴(kuò)增，該病毒還加入了2個(gè)35 S啟動(dòng)子，并且在C端還加入了核酶。而TRV-2b的版本病毒載體中含有TRV RNA2中的2b序列。目前，TRV的病毒載體已在番茄、煙草、棉花（Gossypium spp.）、牽?；╗33]、擬南芥和罌粟（opium poppy）[34]等多種植物上被應(yīng)用。2002年，Holzberg等[35]利用大麥條紋花葉病毒BSMV攜帶PDS片段，成功引起了大麥的白化現(xiàn)象，抑制了大麥PDS基因的表達(dá)，這是首次利用VIGS載體在單子葉植物上實(shí)現(xiàn)了基因沉默。2006年，Ding等[36]用雀麥花葉病毒（Brome mosaic virus，BMV）進(jìn)行改造，同樣成功地在水稻、玉米等單子葉植物中完成了對(duì)基因沉默的研究。endprint

5 小結(jié)與展望

總而言之，植物病毒載體目前主要的應(yīng)用體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：一是用于分析基因功能，特別是分析被沉默基因的功能的較多，即用于病毒誘導(dǎo)的基因沉默；二是用于表達(dá)藥物蛋白。植物病毒載體用于利用外源基因功能的研究很少，如病毒載體在用于表達(dá)抗性基因增強(qiáng)植物抗性方面的研究報(bào)道很少，原因可能主要是由于病毒的擴(kuò)散和致病性引起安全性問題，難以實(shí)際應(yīng)用。

植物病毒載體穩(wěn)定性相對(duì)較差，病毒載體中插入或置換的外源基因大小受到限制，病毒載體的接種方法較為昂貴和繁瑣，可移動(dòng)病毒載體存在一定的安全性問題，這些問題都阻礙病毒載體的應(yīng)用和發(fā)展，因此植物病毒載體仍有待進(jìn)一步研究改進(jìn)。

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