四川地區(qū)豬腸外致病性大腸桿菌的分離鑒定與耐藥性檢測

王 斌 ，袁定勝 ，李金良 ，李思聰 ，李旭廷 *

（1.四川省畜牧科學(xué)研究院獸藥研究所，四川 成都 610066；2.動物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610066）

腸外致病性大腸桿菌（ExPEC）是一類定植于腸道外組織并引起嚴(yán)重感染的大腸桿菌。臨床上可引起人的泌尿系統(tǒng)感染、新生兒腦膜炎、敗血癥、肺炎、心內(nèi)膜炎，家禽的腹膜炎、肉芽腫及豬的敗血癥、肺炎、腦膜炎[1-3]。為了解四川地區(qū)豬源ExPEC的流行情況，筆者對一些臨床病死豬進(jìn)行了ExPEC的分離鑒定，同時(shí)進(jìn)行了藥敏實(shí)驗(yàn)，為豬源ExPEC的防控及藥物治療提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料

1.1 樣本采集 從四川地區(qū)多個豬場采集病死豬的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、淋巴結(jié)、血液作為病料樣本，置無菌樣品袋中，冰盒保存，12h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌分離。

1.2 試劑、培養(yǎng)基和標(biāo)準(zhǔn)菌株 麥康凱瓊脂、營養(yǎng)肉湯、MH瓊脂、普通營養(yǎng)瓊脂、藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑公司；標(biāo)準(zhǔn)菌株：大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC 25922）購自中國獸藥監(jiān)察所。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物 昆明系SPF小鼠，購自四川達(dá)碩生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 病料接種 無菌切取病變組織和正常組織交界處的小組織塊置肉湯培養(yǎng)基中，37℃下進(jìn)行24 h增菌培養(yǎng)。然后蘸取增菌液劃線于麥康凱瓊脂平板和伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，37℃純化培養(yǎng)24h。

2.2 菌落形態(tài)特征觀察 伊紅美藍(lán)瓊脂上出現(xiàn)黑色、棕綠色且?guī)в薪饘俜垂獾木浠蛑行暮邳c(diǎn)邊緣呈灰白色的表面光滑的菌落，麥康凱瓊脂上出現(xiàn)典型紅色、粉紅色的光滑菌落；1000×油鏡下檢測為革蘭氏陰性桿菌。符合以上特征的基本判定為大腸桿菌，然后可作進(jìn)一步的分子鑒定。

2.3 16S rDNA PCR測序鑒定[4]從伊紅美藍(lán)瓊脂或麥康凱瓊脂上挑取純化后的典型單個菌落進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)，擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA基因。引物為通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和 1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′），由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min，95℃ 1 min、50℃ 1 min、72℃ 2 min（30次循環(huán)），72℃ 8min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，預(yù)擴(kuò)增片段1450bp。PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司純化并測序，序列結(jié)果用NCBI BLAST搜索比對，鑒定標(biāo)準(zhǔn)按照同源性≥97%判定。

2.4 致病性實(shí)驗(yàn)[5]將鑒定了的ExPEC接種到MH瓊脂平板，經(jīng)37℃ 24h純培養(yǎng)，然后用滅菌生理鹽水洗下菌液，調(diào)整渾濁度與0.5麥?zhǔn)媳葷峁埽?×108cfu/mL）相當(dāng)，再分別腹腔注射小白鼠（0.2mL/只），每株菌同時(shí)接種3只小鼠，并設(shè)標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 25922為對照，觀察分離菌株對小鼠的致病性。

2.5 藥敏實(shí)驗(yàn) 根據(jù)CLSI（2009）推薦的K-B法檢測分離菌對12種抗菌藥的耐藥性。將純化后的菌落用滅菌生理鹽水制成懸液，調(diào)整菌液渾濁度與0.5麥?zhǔn)媳葷峁芟喈?dāng)。用固定大小的無菌棉拭子蘸取菌懸液，在MH瓊脂平板上均勻涂抹接種，以大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 25922作藥敏實(shí)驗(yàn)質(zhì)控菌。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌分離 從52個豬場采集的210個病料組織中，分離到了麥康凱瓊脂上形態(tài)為典型的紅色、光滑、圓形或水滴狀菌落，伊紅美蘭瓊脂上呈黑色或棕綠色有金屬反光的光滑菌落。經(jīng)16S rDNA PCR鑒定，得出ExPEC共40株，分離率達(dá)19.1%。各個臟器的分離率分別為肺臟32.5%（13/40），淋巴結(jié)22.5%（9/40），肝臟 10%（4/40），心臟 7.5%（3/40），脾臟7.5%（3/40），腎臟 5.0%（2/40），血液 15.0%（6/40）。

3.2 致病性實(shí)驗(yàn) 40株ExPEC攻毒小鼠后，有10株導(dǎo)致1只小鼠死亡，18株導(dǎo)致2只小鼠死亡，12株導(dǎo)致3只小鼠死亡，平均致死率為68.3%。引起至少2只小鼠死亡的30株菌中，有26株引起小鼠死亡的時(shí)間不超過18h。從死亡小鼠的肺臟、肝臟等器官中也分離到了同種菌。對照組無死亡。

3.3 藥敏實(shí)驗(yàn) 40株ExPEC中，34株表現(xiàn)為耐6種受試藥物以上的多重耐藥；對四環(huán)素、氨芐西林和卡那霉素耐藥嚴(yán)重，耐藥率大于80%；對氨芐西林/舒巴坦、阿米卡星、頭孢克肟保持較高的敏感性，耐藥率小于20%。藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

4 討論

4.1 本試驗(yàn)所采樣的病死豬來源于四川地區(qū)不同規(guī)模的豬場，發(fā)病豬至少包含以下癥狀（高熱、咳喘、關(guān)節(jié)腫大、皮膚發(fā)紅、敗血癥、腦膜炎）之一。在臨床診斷、病理診斷及實(shí)驗(yàn)室診斷中發(fā)現(xiàn)，幾乎所有病例都檢測到兩種以上的病原菌混合感染，常見的有鏈球菌、巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌、胸膜肺炎放線桿菌，說明臨床上豬病的感染以多重感染為主。本試驗(yàn)中ExPEC的分離率為19.1%，與曾博等報(bào)道的“2008～2011年西南地區(qū)豬源ExPEC的分離率為18.5%”相似[6]，表明豬源ExPEC在四川地區(qū)的流行情況近年比較穩(wěn)定。試驗(yàn)數(shù)據(jù)還顯示，ExPEC在病死豬肺臟里的分離比例最高（32.5%），與徐引弟等[7]報(bào)道的一致。

表1 ExPEC臨床分離株的耐藥性檢測

4.2 本次藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，40株ExPEC分離株對四環(huán)素、氨芐西林和卡那霉素的耐藥性最強(qiáng)，最可能的原因是這些藥物在獸醫(yī)臨床上已應(yīng)用多年，是長時(shí)間選擇壓力下篩選的必然結(jié)果。分離株對氨芐西林/舒巴坦、阿米卡星、頭孢克肟表現(xiàn)出相對較好的敏感性，與曾博等報(bào)道的結(jié)果一致[6]，可能是因?yàn)檫@三種藥物在我國還未批準(zhǔn)用于獸醫(yī)臨床，因而不存在藥物選擇壓力，耐藥性較小。

4.3 本試驗(yàn)表明，四川地區(qū)豬源ExPEC有一定的流行，肺臟分離率最高，且多具有較強(qiáng)的致病性和多藥耐藥性。臨床上預(yù)防和治療豬ExPEC感染，推薦使用和頭孢克肟一樣同為第三代頭孢的動物專用藥——頭孢噻呋或β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的復(fù)方制劑——阿莫西林/克拉維酸。

[1]Russo T A，Johnson J R.Medical and economic im-pact of extraintestinal infections due to Escherichia coli: focus on an increasingly important endemic problem[J].Microbes Infect，2003（5）:449-456.

[2]Tang X，Tan C，Zhang X，et al.Antimicrobial resistances of extraintestinal pathogenic Escherichia coli isolates from swine in China[J].Microb Pathog，2011，50（5）:207-212.

[3]Yang H，Chen S，White D G，et al.Characterization of multiple-antimicrobial-resistantEscherichia coliisolates from diseased chickens and swine in China[J].J Clin Microbiol，2004，42（8）:3483-3489.

[4]Wilson K H，Blitchington R B，Greene R C.Amplification ofbacterial16S ribosomalDNA with polymerase chain reaction[J].J Clin Microbiol，1990，28:1942-1946.

[5]Johnson J R，Clermont O，Menard M，et al.Experimental mouse lethality of Escherichia coli isolates， in relation to accessory traits， phylogenetic group， and ecological source[J].J Infect Dis，2006，194:1141-1150.

[6]曾博，王紅寧，鄒立扣，等.西南地區(qū)豬腸外大腸桿菌毒力基因檢測及耐藥性研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，35（2）:126-129.

[7]徐引弟，王治方，朱文豪，等.豬腸外致病性大腸桿菌的分離鑒定和藥敏試驗(yàn)[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，40（1）:150-153.