脂聯(lián)素在重癥急性胰腺炎脂肪組織中的表達(dá)及意義

韓超群，楊 芬，劉 俊，錢 偉，丁 震

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北 武漢430022

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是臨床上常見危重癥，其病情發(fā)展迅速，早期即可出現(xiàn)多器官功能障礙綜合征(MODS)，死亡率高達(dá)20% ～30%［1］。肥胖不僅作為急性胰腺炎的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，它同時(shí)還增加急性胰腺炎的死亡率［2］，但其機(jī)制尚未完全清楚，脂肪組織作為儲(chǔ)脂器官，同時(shí)也分泌一系列脂肪因子和細(xì)胞因子，本研究主要探討脂肪細(xì)胞因子脂聯(lián)素(diponectin)及部分炎癥因子在SAP 脂肪組織中的表達(dá)、作用及可能的意義。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 12 只SD 雄性大鼠購自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心，?；悄懰徕c購自ACROS ORGANICS，Trizol 購自invitrogen 公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa 公司，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR 擴(kuò)增試劑盒購自QIAGEN 公司。

1.2 分組及模型制備 12 只SD 大鼠體質(zhì)量240 ～350 g，平均體質(zhì)量290 g，稱重編號(hào)后隨機(jī)分為2 組:假手術(shù)對(duì)照組(N 組)、SAP 組，每組6 只。實(shí)驗(yàn)前SD大鼠禁食不禁水，SAP 組采用1%戊巴比妥鈉4 ml/kg腹腔麻醉、開腹，胰膽管推注5% 牛黃膽酸鈉1 ml/kg制成SAP 模型，N 組SD 大鼠開腹后不經(jīng)胰膽管推注5%牛黃膽酸鈉，僅翻動(dòng)十二指腸及胰腺組織數(shù)次后關(guān)腹。2 組分別于24 h 內(nèi)處死取附睪旁脂肪組織。

1.3 脂肪組織內(nèi)脂聯(lián)素、IL-10、TGF-β1、TNF-α 表達(dá)的檢測 用Trizol 提取脂肪細(xì)胞內(nèi)的RNA(將混有Trizol 的脂肪組織研磨均勻放置5 min 并4 ℃、12 000 r/min 15 min 離心后EP 管最上層為油脂，盡量吸除油脂，提高純度，氯仿可重復(fù)1 次)。RT-PCR 法檢測mRNA 表達(dá)量，PCR 反應(yīng)條件:95 ℃10 min、95 ℃15 s、60 ℃1 min，40 個(gè)循環(huán)。引物由上海英駿公司合成，序列如下:GAPDH 上游:TCTTCCAGGAGCGAGATCCC，下游:TTCAGGTGAGCCCCAGCCTT;脂聯(lián)素上游:CTGGCTCCAAGTGTATGGGG，下游:TTTGATTCTCGGG GCTACGG;IL-10 上游:AGAAGGACCAGCTGGACAACAT，下 游:CAAGTAACCCTTAAAGTCCTGCAGTA;TGF-β1 上游:AACTACTGCTTCAGCTCCAC，下游TGTGTCCAGGCTCCAAATGTA;TNF-α 上游:CCGATTTGCCACT TCATACCA，下游:TAGGGCAAGGGCTCTTGATG。

1.4 脂肪組織病理學(xué)檢查 取脂肪組織4%多聚甲醛固定，冰凍切片并行HE 染色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用單因素方差分析，所有數(shù)據(jù)用s 表示，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脂肪組織肉眼改變 N 組:大鼠腹腔見極少量黃色腹水，附睪旁脂肪組織大致正常;SAP 組:腹腔可見少量血性腹水，附睪旁脂肪組織及周邊臟器見大量皂化斑。

2.2 脂肪組織光鏡下病理改變 N 組:脂肪組織大致正常;SAP 組:脂肪組織見周圍毛細(xì)血管增生及單核巨噬細(xì)胞浸潤增加。

圖1 脂肪組織肉眼改變 A:N 組;B:SAP 組;圖2 脂肪組織光鏡下病理改變(HE 400 ×) A:N 組;B:SAP 組Fig 1 Adipose tissue changes by macroscopic observation A:N group;B:SAP group;Fig 2 Hispathological changes of adipose tissue (HE 400 ×) A:N group;B:SAP group

2.3 脂肪組織脂聯(lián)素及炎癥因子的表達(dá)

2.3.1 脂肪組織炎癥因子的表達(dá):與N 組相比，SAP 組促炎因子TNF-α 及IL-10 上升明顯(P ＜0.05);抑炎因子TGF-β1 顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

表1 兩組脂肪組織炎癥因子IL-10、TGF-β1、TNF-α 表達(dá)水平比較(ng/L，s)Tab 1 Comparison of expression levels of IL-10，TGF-β1，TNF-α between two groups (ng/L，s)

表1 兩組脂肪組織炎癥因子IL-10、TGF-β1、TNF-α 表達(dá)水平比較(ng/L，s)Tab 1 Comparison of expression levels of IL-10，TGF-β1，TNF-α between two groups (ng/L，s)

分組 IL-10 TGF-β1 TNF-α N 組 0.00097±0.00017 0.0595±0.0070 0.00153±0.0 0017 SAP 組 0.00272±0.00027 0.0182±0.0053 0.00317±0.00042 P 值0.002 0.012 0.004

2.3.2 脂肪組織脂聯(lián)素的表達(dá):與N 組相比，SAP 組脂聯(lián)素下降明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01，見圖3)。

圖3 脂肪組織脂聯(lián)素的表達(dá) A:N 組;SAP 組Fig 3 The expression levels of adiponectin in the adipose tissues of normal and SAP group A:N group;B:SAP group

3 討論

目前普遍認(rèn)為SAP 發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制是各種病因?qū)е乱幌盗屑?xì)胞因子、免疫細(xì)胞及補(bǔ)體系統(tǒng)參與的炎癥級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，這些細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)呈網(wǎng)絡(luò)交叉反應(yīng)，協(xié)同形成對(duì)組織器官的損傷。TNF-α 主要由活化的單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是SAP 發(fā)病機(jī)制中的啟動(dòng)介質(zhì)，它可刺激促炎因子的表達(dá)、趨化、細(xì)胞死亡及內(nèi)皮細(xì)胞活化［3］。IL-10 是一種重要的炎癥負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子，它能夠抑制單核-巨噬細(xì)胞、T 細(xì)胞的激活和效應(yīng)功能，抑制TNF-α、IL-6 等促炎細(xì)胞因子的合成［4］。TGF-β1 是一種具有多重生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，主要調(diào)節(jié)免疫、促進(jìn)蛋白多糖、膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)合成，抑制其降解，刺激結(jié)締組織形成，它的表達(dá)對(duì)調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)及纖維化起重要作用。研究認(rèn)為，由于全身炎癥刺激及胰腺受損，靜止的胰腺星形細(xì)胞(pancreatic stellate cells，PSC)被激活并轉(zhuǎn)化為肌纖維母細(xì)胞，合成纖維連接蛋白、膠原等細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)創(chuàng)傷部位的纖維化［5］，而TGF-β 能使PSC 發(fā)生轉(zhuǎn)化激活［6］。本實(shí)驗(yàn)中，TGF-β1 在SAP 脂肪組織中高表達(dá)，高度提示TGF-β1 可能與胰腺再生及修復(fù)密切相關(guān)。

脂肪組織不再被認(rèn)為是單一的儲(chǔ)脂器官，更重要的是內(nèi)分泌及免疫功能，它同時(shí)也分泌TNF-α、TGFβ1、IL-1、IL-6 等細(xì)胞因子［7-8］。肥胖是SAP 及其并發(fā)癥的危險(xiǎn)因素［2］，其機(jī)制尚未完全清楚，研究脂肪組織具有迫在眉睫的意義，脂聯(lián)素在SAP 脂肪組織中的表達(dá)國內(nèi)外尚未有報(bào)道。脂聯(lián)素由Scherer 等在1995年首次報(bào)道，是主要由脂肪細(xì)胞分泌、含量豐富的補(bǔ)體因子(C1q)，它參與糖脂代謝、抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)免疫、防止內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂等許多重要的生理過程［9］。文獻(xiàn)報(bào)道，SAP 血脂聯(lián)素濃度與正常組相比，明顯下降［10］;而上調(diào)脂聯(lián)素受體能減輕SAP 的嚴(yán)重程度［11］。Araki 等［12］用基因敲除的方法證實(shí)缺乏脂聯(lián)素基因的急性胰腺炎肥胖大鼠，其胰腺炎嚴(yán)重程度較正常胰腺炎組明顯加重。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣證實(shí)與正常對(duì)照組相比，SAP 組脂肪組織脂聯(lián)素mRNA 低表達(dá)(P ＜0.0001)，提示脂肪組織脂聯(lián)素與SAP 的發(fā)病可能具有一定的關(guān)聯(lián)性，脂聯(lián)素在SAP 中起保護(hù)性作用。

脂聯(lián)素可能通過以下幾種途徑發(fā)揮在SAP 中的作用:(1)脂聯(lián)素通過cAMP-PKA 途徑抑制NF-κB 磷酸化，從而抑制TNF-α 介導(dǎo)的NF-κB 活化，進(jìn)而抑制其誘生的血管黏附分子(VCAM)-1、細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1 的表達(dá)，且存在劑量依賴性［13］。體外實(shí)驗(yàn)給予外源性TNF-α，脂肪組織中脂聯(lián)素mRNA 的表達(dá)量顯著下調(diào)，脂聯(lián)素受體1 表達(dá)明顯上升［14］，進(jìn)一步支持脂聯(lián)素對(duì)TNF-α 的抑制作用。(2)抗炎因子IL-10 通過抑制NF-κB 通路的激活，在轉(zhuǎn)錄水平抑制炎性介質(zhì)的產(chǎn)生［15］，而脂聯(lián)素能誘導(dǎo)人類單核細(xì)胞合成IL-10 及可溶性IL-1 受體拮抗劑，體外實(shí)驗(yàn)中，Evans、Kumada 等［2，16］用人重組脂聯(lián)素培養(yǎng)人類單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞，均以劑量依賴性顯著增加IL-10 mRNA及蛋白水平。(3)脂聯(lián)素通過AMPK 信號(hào)傳導(dǎo)途徑促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞eNOS 磷酸化，增強(qiáng)eNOS 在內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)和活性，內(nèi)皮細(xì)胞NO 的生成有助于抑制血管炎癥反應(yīng)［17］。(4)SAP 患者腸黏膜屏障遭到破壞，腸黏膜的通透性增高，內(nèi)毒素通過門靜脈進(jìn)入體循環(huán)，發(fā)生腸源性內(nèi)毒素血癥［18］，內(nèi)毒素也可活化肥大細(xì)胞，脫顆粒釋放組胺，進(jìn)一步引起腸黏膜通透性增高，此種惡性循環(huán)是導(dǎo)致SAP 并發(fā)多器官衰竭的主要原因之一，而脂聯(lián)素能夠直接中和內(nèi)毒素，并且降低膿毒敗血癥大鼠內(nèi)毒素活性［19］。

脂肪組織作為內(nèi)分泌及免疫組織，其所分泌的細(xì)胞因子對(duì)機(jī)體物質(zhì)代謝、肥胖、SAP 及其并發(fā)癥等有重要作用，脂肪細(xì)胞因子是銜接肥胖與SAP 之間重要的橋梁，深入認(rèn)識(shí)脂聯(lián)素在SAP 中的作用有可能為SAP的治療開辟新的途徑。

［1］ Zhu HH，Jiang LL. Serum inter-cellular adhesion molecule 1 is an early markerof diagnosis and prediction of severe acute pancreatitis［J］.World J Gastroenterol，2012，18(20):2554-2560.

［2］ Evans AC，Papachristou GI，Whitcomb DC. Obesity andthe risk of severe acute pancreatitis［J］. Minerva Gastroenterol Dietol，2010，56(2):169-179.

［3］ Malleo G，Mazzon E，Siriwardena AK，et al. Role of tumor necrosis factor-alpha in acute pancreatitis:from biological basis to clinical evidence［J］. Shock，2007，28(2):130-140.

［4］ Grutz G. New insights into the molecular mechanism ofinterleukin-10-mediated immunosuppression［J］. J Leukoc Biol，2005，77(1):3-15.

［5］ Masamune A，Shimosegawa T. Signal transduction in pancreatic stellate cells［J］. J Gastroenterol，2009，44(4):249-260.

［6］ Gao X，Cao Y，Yang W，et al. BMP2 inhibits TGF-β-induced pancreatic stellate cell activation and extracellular matrix formation ［J］.2013，304(9):G804-G813.

［7］ Simons PJ，van den Pangaart PS，van Roomen CP，et al. Cytokinemediated modulation of leptin and adiponectin secretionduring in vitro adipogenesis:evidence that tumor necrosisfactor-alpha-and interleukin-1beta-treated human preadipocytesare potent leptin producers［J］. Cytokine，2005，32(2):94-103.

［8］ Tilg H，Moschen AR. Adipocytokines:mediators linkingadipose tissueinflammation andimmunity［J］. Nat Rev Immunol，2006，6(10):772-783.

［9］ Antoniades C，Antonopoulos AS，Tousoulis D，et al. Adiponectin:from obesity to cardiovascular disease［J］. ObesRev，2009，10(3):269-279.

［10］ Zyromski NJ，Mathur A，Pitt HA，et al. A murine model of obesity implicates theadipokine milieu in the pathogenesis of severe acutepancreatitis［J］. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2008，295(3):G552-G558.

［11］ Al-Azzawi HH，Ziegler KM，Swartz-Basile DA，et al. Does adiponectin upregulation attenuate the severity of acute pancreatitis in obesity［J］. J Gastrointest Surg，2011，15(8):1394-1400.

［12］ Araki H，Nishihara T，Matsuda M，et al. Adiponectin plays a protective role in caerulein-inducedacute pancreatitis in mice fed a high-fat diet［J］. Gut，2008，57(10):1431-1440.

［13］ Ouchi N，Kihara S，Arita Y，et al. Adiponectin，anadipocyte-derived plasmaprotein，inhibits endothelial NF-kappaB signaling through a cAMPdependentpathway［J］. Circulation，2000，102(11):1296-1301.

［14］ Hector J，Schwarzloh B，Goehring J，et al. TNF-alpha alters visfatin and adiponectin levels in human fat［J］. Horm Metab Res，2007，39(4):250-255.

［15］ Dhingra S，Sharma AK，Arora RC，et al. IL-10 attenuates TNF-α induced NF-κB pathway activation and cardiomyocyte apoptosis［J］.Cardiovasc Res，2009，82(1):59-66.

［16］ Kumada M，Kihara S，Ouchi N，et al. Adiponectin specifically increasedtissue inhibitor of metalloproteinase-1 through interleukin-10 expression inhuman macrophages［J］. Circulation，2004，109(17):2046-2049.

［17］ Ouchi N，Kobayashi H，Kihara S，et al. Adiponectin stimulates angiogenesis by promoting cross-talk between AMP-activated protein kinase and Aktsignaling in endothelial cells［J］. J Biol Chem，2004，279(2):1304-1309.

［18］ Zhang J，Yuan C，Hua G，et al. Early gut barrier dysfunction in patients withsevere acute pancreatitis:attenuated by continuousblood purification treatment ［J］. Int J Artif Organs，2010，33(10):706-715.

［19］ Tsuchihashi H，Yamamoto H，Maeda K，et al. Circulating concentrationsof adiponectin，anendogenous lipopolysaccharide neutralizing protein，decrease in rats with polymicrobial sepsis ［J］. J Surg Res，2006，134(2):348-353.