+Gz 暴露對實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍大鼠胃黏膜CGRP-mRNA 表達(dá)和血清NO、ET 的影響

趙 錕，陳 英，范 勤，李 靜，唐和蘭，楊春敏，王建昌

河北北方學(xué)院中國人民解放軍空軍總醫(yī)院臨床學(xué)院1.干部病房消化科;2.麻醉科;3.醫(yī)院辦公室，北京100142

整個消化道是人體最大、最復(fù)雜的內(nèi)分泌器官，其內(nèi)分泌細(xì)胞種類繁多、功能各異，與神經(jīng)系統(tǒng)和外分泌腺相互配合，共同調(diào)控著消化道的運(yùn)動、分泌、血流、細(xì)胞營養(yǎng)等功能［1-2］。當(dāng)不利的內(nèi)、外環(huán)境導(dǎo)致上述調(diào)節(jié)功能紊亂時，會對胃腸道造成不同程度的病理損傷。有研究［3-4］表明，一些胃腸肽及中介因子(如降鈣素基因相關(guān)肽、NO、前列腺素等)在胃腸防御和修復(fù)方面起重要作用。消化性潰瘍是多因素綜合作用導(dǎo)致的身心疾?。?］。飛行員暴露于高正加速度(positive acceleration，+Gz)、低氧等特殊環(huán)境中，合并超強(qiáng)度的工作負(fù)荷和心理壓力，致使?jié)儾〉陌l(fā)病率和復(fù)發(fā)率高于其他人群，引起了航天航空醫(yī)學(xué)界的高度重視，相關(guān)研究也在逐漸增多。邵穎錟等［6-7］證明+Gz 暴露會加重胃黏膜損傷、延遲潰瘍愈合、降低潰瘍的愈合質(zhì)量，其機(jī)制可能與血液中降鈣素基因相關(guān)肽降低有關(guān)。但目前相關(guān)研究尚未深入到mRNA 表達(dá)水平。因此，我們建立胃潰瘍模型，觀察不同+Gz 條件下胃黏膜降鈣素基因相關(guān)肽 mRNA (calcitonin gene-related peptidemRNA，CGRP-mRNA)的表達(dá)和血清中NO、內(nèi)皮素(endothelin，ET)的變化情況，并探討+Gz 暴露影響潰瘍愈合的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物:40 只雄性SD 大鼠，清潔SPF 級，體質(zhì)量(200 ±10)g，購自中國軍事科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號:SCXK-(軍)-2012-0004，空調(diào)下飼養(yǎng)，溫度(20 ±2)℃，濕度50% ～60%，光照每12 h 明暗交替，通風(fēng)8 ～15 次/h，食用中國軍事科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動物中心提供的全營養(yǎng)顆粒飼料，自由飲食。

1.1.2 試劑與儀器:小動物離心機(jī)(由航天航空醫(yī)學(xué)研究所提供)，Real-time PCR 儀(美國ABI 7500)，計(jì)算機(jī)圖像分析儀(Image-Pro Plus Analysis Soft Ware)，Trizol 試劑盒(Invitrogen 公司)，M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara 公司)，Real-time PCR 擴(kuò)增試劑盒(北京中原領(lǐng)先科技有限公司)，NO 試劑盒、ET 試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所)，無菌動物手術(shù)器械及縫合線等(由航天航空醫(yī)學(xué)研究所提供)，戊巴比妥鈉(Sigma 公司)，慶大霉素(廣州白云山天心制藥股份有限公司)，100%乙酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，碘伏消毒液(北京四環(huán)衛(wèi)生藥械廠有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組:40 只雄性SD 大鼠隨機(jī)分成4 組，每組10 只，對照組(A 組)、模型組(B 組)、模型+5 Gz暴露組(C 組)、模型+10 Gz 暴露組(D 組)。

1.2.2 造模:采用經(jīng)典的Okabe［8］方法(即乙酸燒灼致胃潰瘍模型的方法)，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)條件略作調(diào)整:大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，造模前禁食不禁水24 h，稱重，以3%戊巴比妥鈉按1.5 ml/kg 腹腔注射麻醉，固定大鼠，腹部剃毛，消毒，于劍突沿腹正中線打開腹腔，手術(shù)切口1.5 ～2.0 cm，暴露出胃，注意動作輕柔，用浸有100%乙酸、直徑為0.5 cm 的圓形濾紙片貼于胃竇小彎處(避開血管)2 次，每次30 s，1 min 后迅速吸去殘存的乙酸，用5 號線將大網(wǎng)膜覆蓋乙酸燒灼處縫合于胃壁上，輕輕還納胃，用生理鹽水沖洗腹腔，洗凈后注入0.5 ml 慶大霉素以預(yù)防感染和粘連，最后縫合腹壁，消毒。將大鼠放回鼠籠，注意室內(nèi)清潔，溫度適宜，手術(shù)后注意觀察大鼠飲食、活動、皮毛色澤及手術(shù)切口愈合情況。

1.2.3 +Gz 暴露:采用動物離心機(jī)模擬+Gz 暴露，利用特制的固定盒承載大鼠，大鼠頭朝向離心機(jī)軸心，俯面固定于離心機(jī)轉(zhuǎn)臂遠(yuǎn)端，每組6 只同時上機(jī)。采用梯形+Gz 作用曲線，G 值增長率為1 G/s(由計(jì)算機(jī)進(jìn)行加速度程序控制)。造模后3 d 對大鼠予以+Gz處理，A 組大鼠不做處理，B 組大鼠進(jìn)行地面捆綁5 min，C 組大鼠進(jìn)行+5 Gz 值旋轉(zhuǎn)5 min，D 組大鼠+10 Gz 旋轉(zhuǎn)5 min，每隔1 d 進(jìn)行1 次，持續(xù)1 周，共4 次。

1.2.4 標(biāo)本采集及檢測:經(jīng)處理后的各組大鼠均存活。(1)1 周后，大鼠禁食不禁水12 h，麻醉、固定、打開腹腔，用一次性采血針于腹主動脈處采集血標(biāo)本4 ml，在-4 ℃，3 000 r/min 條件下離心20 min，取上清液置于EP 管中-80 ℃冰箱保存，待測;(2)胃黏膜標(biāo)本采集:取出大鼠的胃，沿胃大彎側(cè)剪開，于紗布上展開、鋪平，用刀片輕輕刮取胃黏膜組織置于EP 管中-80 ℃保存，待測;(3)血清中NO、ET 的測定:用比色法測定血清中NO 的含量，用放免法測定血清中ET含量(具體操作嚴(yán)格按說明書進(jìn)行)。

CGRP-mRNA 含量的測定:采用實(shí)時熒光RTPCR 方法進(jìn)行定量測定。(1)從組織中獲取總RNA:將組織從液氮中取出，放入預(yù)冷的研缽中加入液氮進(jìn)行快速研磨，然后將粉末裝入預(yù)冷的EP 管中進(jìn)行RNA 的提取，具體步驟嚴(yán)格按照Trizol 試劑盒說明書進(jìn)行;(2)核酸紫外分光光度計(jì)測定稀釋后RNA 提取物的吸光度(OD)值和濃度，判斷RNA 純度;(3)RNA的反轉(zhuǎn)錄:將20 μl 的反轉(zhuǎn)錄體系物質(zhì)(RNA 5 μl，Oligo(dT)2 μl，dd H2O(DEPC 處理)4.5 μl，5 ×Buffer 5 μl，dNTP(10 mmol/L)2 μl，Ribonuclease inhibitor 0.5 μl，M-MLV RT 1 μl)加入0.5 ml 的離心管中。具體步驟按M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行;(4)RTPCR:將所得的cDNA 與20 μl RT-PCR 體系物質(zhì)［cDNA 2 μl，F(xiàn)orward primer (10 pmol/μl)］0. 5 μl，Reverse primer (10 pmol/μl)0.5 μl，SYBR mix 10 μl，dd H2O 7 μl)加入0.2 ml 的離心管中混勻反應(yīng)，具體反應(yīng)參數(shù)和步驟按RT-PCR 擴(kuò)增試劑盒說明書進(jìn)行，并以β-actin 作為內(nèi)參(PCR 條件同上)，整個過程由計(jì)算機(jī)自動收集數(shù)據(jù)，繪制曲線。CGRP 引物序列為:Forward primer 5＇-CTCTAGTGTCACTGCCCAGAA-3＇，Reverse primer 5＇-CTTCAGAGCCCACATTGGT-3＇，片段長131 bp。β-actin 引物序列:Forward primer 5＇-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3＇，Reverse primer 5＇-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3＇，片段長150 bp;(5)數(shù)據(jù)分析:讀取數(shù)據(jù)，用相對定量2-ΔΔCT法分析結(jié)果，用2-ΔΔCT計(jì)算各個樣本CGRP-mRNA 的表達(dá)變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用±s 表示，采用方差分析方法(多樣本均數(shù)比較用單因素方差分析，組間均數(shù)兩兩比較若方差齊性，用LSD 法;若方差不齊性，用Dunnetts，T3 方法)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 +Gz 暴露對實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍大鼠胃黏膜CGRPmRNA 表達(dá)的影響 與A 組相比，B、C、D 組CGRPmRNA 表達(dá)均增加，其中D 組增加不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05);與B 組比較，造模后C 組和D組CGRP-mRNA 表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，且D 組降低更顯著;D 組與C 組比較，CGRPmRNA 表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05，見表1)。

表1 不同+Gz 暴露后大鼠胃黏膜CGRP-mRNA 的含量(±s)Tab 1 The content of CGRP-mRNA in gastric mucosa of rats exposed to different +Gz (±s)

表1 不同+Gz 暴露后大鼠胃黏膜CGRP-mRNA 的含量(±s)Tab 1 The content of CGRP-mRNA in gastric mucosa of rats exposed to different +Gz (±s)

注:與A 組比較，aP ＜0.05;與B 組比較，bP ＜0.05;與C 組比較，cP ＜0.05。

分組 只數(shù) CGRP-mRNA(2 -ΔΔCT )A 組10 0.966 ±0.089 B 組 10 3.090 ±0.154a C 組 10 2.263 ±0.166ab D 組 10 1.096 ±0.077 bc

2.2 +Gz 暴露對實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍大鼠血清中NO、ET的影響 與A 組相比，B 組NO 含量降低、ET 含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);+Gz 暴露后，C 組較B 組NO 含量明顯升高，ET 含量明顯降低(P ＜0.05);D 組與C 組比較，NO 含量下降，但仍高于B組;對應(yīng)ET 含量升高，但仍低于B 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05，見表2)。

3 討論

消化性潰瘍主要指發(fā)生于胃和十二指腸的慢性潰瘍，其與胃酸分泌過多、H.pylori 感染、胃腸肽的作用、遺傳因素、藥物因素、環(huán)境因素和精神因素等有關(guān)，是飛行人員中發(fā)病率和復(fù)發(fā)率較高的慢性病之一，這與飛行員特殊的工作性質(zhì)和工作環(huán)境有關(guān)。飛行員飛行時，會受到與加速度相反的慣性離心力作用，其方向由頭部指向足，即+Gz，會使器官沿慣性力方向發(fā)生變形、移位，血液發(fā)生慣性轉(zhuǎn)移和重新分布。在+Gz條件下，會激發(fā)藍(lán)斑- 交感- 腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)和下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)［9］，影響胃腸激素的分泌及炎癥介質(zhì)的釋放，使神經(jīng)-內(nèi)分泌-外分泌系統(tǒng)對胃腸道的調(diào)控紊亂，使胃酸分泌增加，胃黏膜血管痙攣，胃排空延遲，上皮完整性破壞等［10］，導(dǎo)致潰瘍的發(fā)生或復(fù)發(fā)。在前期有關(guān)+Gz 條件下血清中胃腸激素變化研究基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)從胃黏膜局部深入到分子水平研究了+Gz 條件下胃黏膜CGRP-mRNA 表達(dá)情況，并同步觀察血清中NO、ET 的變化。

表2 不同+Gz 暴露后大鼠血清中NO、ET 的含量(±s)Tab 2 The contents of NO and ET in serum of rats exposed to different +Gz(±s)

表2 不同+Gz 暴露后大鼠血清中NO、ET 的含量(±s)Tab 2 The contents of NO and ET in serum of rats exposed to different +Gz(±s)

注:與A 組比較，aP ＜0.05;與B 組比較，bP ＜0.05;與C 組比較，cP ＜0.05。

組別 NO(μmol/L) ET(pg/ml)53.791 ±3.028 71.427 ±2.582 B 組 47.776 ±2.832a 94.879 ±3.577a C 組 62.585 ±3.407b 82.257 ±5.898b D 組 59.409 ±1.644bc 87.694 ±4.353 A 組bc

CGRP 是人和哺乳動物體內(nèi)存在的一種含37 個氨基酸殘基的多肽，相對分子質(zhì)量為3 786.91 Da，廣泛分布在整個消化道黏膜層、黏膜下、肌間神經(jīng)叢和小血管周圍，是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的舒血管活性物質(zhì)，以胃黏膜層密度最高［11］。在胃中，CGRP 除了神經(jīng)來源外，還存在內(nèi)分泌及免疫細(xì)胞來源［12］。已有研究顯示CGRP 對胃酸分泌和胃腸運(yùn)動有明顯抑制作用，可增加胃黏膜血流，增加十二指腸堿性物質(zhì)的分泌，從而發(fā)揮其對消化道黏膜的保護(hù)作用［13-15］。有學(xué)者在血管水平證明了一些炎癥介質(zhì)、pH、高乳酸、負(fù)荷運(yùn)動、高低溫、噪聲等環(huán)境因素可引起CGRP 的釋放增加［16-17］。也有研究報(bào)道［18］低(2 ～3.5)+Gz 暴露后，血清中CGRP 含量升高，可能是機(jī)體在+Gz 條件下產(chǎn)生的對抗和削弱不利因素的一種保護(hù)性反應(yīng)。本課題組前期實(shí)驗(yàn)證明［7，19］高+Gz 條件下血清中CGRP 含量降低。

本實(shí)驗(yàn)通過RT-PCR 定量觀察胃黏膜局部CGRPmRNA 表達(dá)情況，結(jié)果顯示B 組大鼠胃黏膜CGRPmRNA 表達(dá)高于A 組，而在+5 Gz 暴露后，C 組大鼠胃黏膜CGRP-mRNA 表達(dá)降低，且D 組大鼠顯著低于C組，說明高+Gz 暴露將導(dǎo)致CGRP-mRNA 表達(dá)下降，且隨著+Gz 增高，其作用更加顯著，與上述研究結(jié)果一致?？赡軝C(jī)制為大鼠潰瘍造模后，胃酸分泌增加、炎癥介質(zhì)釋放、炎癥細(xì)胞遷移等直接刺激含CGRP 的神經(jīng)興奮，促進(jìn)CGRP-mRNA 轉(zhuǎn)錄和釋放;在炎癥狀態(tài)或低+Gz 作用時CGRP-mRNA 可作為保護(hù)因素反饋性的增加，以維持胃腸激素的平衡，隨著+Gz 的增加，超過機(jī)體耐受能力時，可能導(dǎo)致胃黏膜CGRP 神經(jīng)功能及內(nèi)分泌功能降低，使CGRP-mRNA 表達(dá)下降，使組織的抗損傷能力減弱，從而加重潰瘍的形成，延遲潰瘍愈合。

NO 是由一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase，NOS)催化精氨酸生成的氣體信使分子，在胃腸組織功能方面起重要的調(diào)節(jié)作用。大量研究［20-21］證明，NO作為一種內(nèi)源性保護(hù)因子，可能通過減少胃酸分泌，增加胃黏膜血流量發(fā)揮作用。以左旋硝基精氨酸(LNNA)抑制NOS 作用減少NO 合成時，胃黏膜血流量降低，潰瘍指數(shù)增加，而以左旋精氨酸(L-Arg)促進(jìn)內(nèi)源性NO 合成時，胃黏膜血流量增加，胃組織損傷減輕。ET 是由21 個氨基酸組成的多肽，是較強(qiáng)的收縮血管物質(zhì)，具有強(qiáng)烈持久的收縮血管和促平滑肌增殖的作用［22］。研究表明［23］應(yīng)激狀態(tài)下胃黏膜局部迷走神經(jīng)興奮，致肥大細(xì)胞等產(chǎn)生組胺、白三烯及ET 增多，最終導(dǎo)致胃黏膜血流量減少、血流淤滯和微循環(huán)障礙，損傷胃黏膜，而抗ET 血清可降低ET 水平，改善胃黏膜血流。高和等［24］認(rèn)為在+5 Gz 暴露后，大鼠血漿中NO 含量升高，ET-1 降低;劉紅巾等［25］認(rèn)為+10 Gz暴露后，大鼠血漿中NO 含量降低，ET-1 升高。本研究分別設(shè)定不同+Gz 值，觀察持續(xù)、反復(fù)暴露后血清中NO、ET 變化情況。結(jié)果顯示:模型組大鼠血清中NO 含量較對照組減少，而ET 升高，可能因潰瘍作為一種嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，組織損傷、缺血、缺氧等使NOS表達(dá)減少且活性降低，而在炎癥因子作用及肥大細(xì)胞參與下，ET 分泌增加，因而模型組NO 含量減少，ET含量增加;+Gz 暴露后，+5 Gz 時，NO 含量顯著增加，ET 含量顯著減少，+10 Gz 時，NO 含量較+5 Gz 有所下降，ET 對應(yīng)升高，但仍高于正常水平，與上述研究結(jié)果相一致。說明低+Gz 值時保護(hù)性因子會有所增加，損傷因子相對減少，而高+Gz 值時正好相反。

總之，CGRP、NO、ET 三者作為較強(qiáng)的血管活性物質(zhì)，共同參與血管張力平衡的調(diào)節(jié)。當(dāng)機(jī)體暴露于+Gz 條件下，三者呈現(xiàn)出規(guī)律性變化，這種變化可能是機(jī)體對+Gz 負(fù)荷狀態(tài)的一種應(yīng)激反應(yīng)，也可能是對抗+Gz 暴露的一種代償性保護(hù)現(xiàn)象。但均一致說明，三者的變化與+Gz 暴露和時間有關(guān)，即適宜的作用負(fù)荷和時間將促使保護(hù)因子CGRP-mRNA、NO 增加，降低損害因子ET 產(chǎn)生，從而使胃黏膜血流量增加，胃酸分泌減少，有利于潰瘍的愈合，而超負(fù)荷時反而會對機(jī)體帶來損傷。這給航天醫(yī)學(xué)工作者以新的啟示:低+Gz預(yù)適應(yīng)可能有利于機(jī)體建立良好的生理代償功能，提高抗+Gz 耐力，逐漸適應(yīng)高+Gz 環(huán)境，使?jié)兊陌l(fā)病率和復(fù)發(fā)率降低，這將有待實(shí)驗(yàn)證實(shí)。除此之外，+Gz作用下胃黏膜局部NOS-mRNA 及ER-mRNA 的變化情況及與胃黏膜CGRP-mRNA 相互作用共同影響潰瘍愈合的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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