RIP3 在小鼠結(jié)腸炎中的表達(dá)及意義

賈振宇，沈家慶，許春芳

蘇州大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇 蘇州215006

在腸道表面覆蓋著一層腸上皮細(xì)胞，它們的主要功能是吸收腸腔內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。腸上皮細(xì)胞也參與到人體的免疫系統(tǒng)中，它們通過(guò)細(xì)胞間的緊密連接形成一道黏膜屏障。但是當(dāng)細(xì)胞發(fā)生過(guò)度死亡時(shí)，腸黏膜屏障遭到破壞，導(dǎo)致腸道炎癥。腸上皮細(xì)胞的死亡可以作為腸道炎癥的標(biāo)志［1］。程序性細(xì)胞壞死是細(xì)胞死亡的一種特殊形式，它受到受體結(jié)合絲氨酸/蘇氨酸激酶3(receptor-interacting protein kinase 3，RIP3)的調(diào)控，當(dāng)細(xì)胞凋亡途徑受到抑制時(shí)，RIP3 可以調(diào)控細(xì)胞走向壞死的路徑［2］。但是程序性細(xì)胞壞死尤其是RIP3 在結(jié)腸炎中發(fā)揮的作用尚不明確。因此，本次實(shí)驗(yàn)旨在探討RIP3 介導(dǎo)的程序性細(xì)胞壞死在小鼠結(jié)腸炎中可能存在的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑 SPF 級(jí)雌性C57BL/6J 小鼠24 只，6 ～8 周齡，體質(zhì)量18 ～19 g，購(gòu)自蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。DSS 購(gòu)自美國(guó)MP 公司。兩步法免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海Genetech 公司，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法試劑盒(ECL)購(gòu)自美國(guó)GeneScript 公司。小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α 多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德公司，小鼠RIP3 多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Prosci 生物公司，羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司，甘油醛-3-磷酸脫 氫 酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體購(gòu)自美國(guó)GeneScript 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 C57BL/6J 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，隨機(jī)分為模型組、正常組，每組12 只。模型組小鼠采用DSS 誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎模型［3］，將DSS 溶于無(wú)菌水中，配置成5%水溶液，小鼠自由飲用4 d，再飲用無(wú)菌水3 d。正常組小鼠自由飲用無(wú)菌水7 d。

1.3 小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評(píng)分 各組小鼠每天檢查體質(zhì)量、腹瀉、便血情況。DAI［4］:腹瀉(0 為正常糞便、1 為濕潤(rùn)/黏性便、2 為中度腹瀉/不成形便、3 為重度腹瀉/水樣便);便血(0 為無(wú)便血、1 為便上帶血點(diǎn)/隱血弱陽(yáng)性、2 為便上見(jiàn)血/隱血強(qiáng)陽(yáng)性、3 為便鮮血);每天測(cè)量小鼠體質(zhì)量并根據(jù)公式計(jì)算體質(zhì)量變化:(第n 天體質(zhì)量- 初始體質(zhì)量)/初始體質(zhì)量×100%，體質(zhì)量變化(0 為體質(zhì)量減少＜2%、1 為體質(zhì)量減少2% ～5%、2 為體質(zhì)量減少5% ～10%、3 為體質(zhì)量減少10% ～15%、4 為體質(zhì)量減少≥15%)。在第7 天，處死小鼠，收集結(jié)腸標(biāo)本，量取長(zhǎng)度，每組中6 只小鼠結(jié)腸組織用10%甲醛固定，剩余6 只小鼠結(jié)腸組織保存于液氮中。

1.4 結(jié)腸組織病理學(xué)檢查 10%甲醛固定后的結(jié)腸標(biāo)本作石蠟包埋、連續(xù)切片。HE 染色觀察結(jié)腸炎癥變化，量化病理學(xué)指數(shù)［4］。

1.5 蛋白樣品制備 小鼠結(jié)腸組織加入RIPA 蛋白裂解液，在冰上打碎制備勻漿，靜置30 min，13 000 r/min離心30 min 后取上清液，測(cè)定并調(diào)整蛋白濃度，與蛋白電泳上樣緩沖液等量混合，98 ℃金屬浴5 min。所得蛋白樣品用于Western blotting 檢測(cè)小鼠IL-1β、IL-6、RIP3、TNF-α 的表達(dá)。

1.6 蛋白電泳分析 蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳用于檢測(cè)小鼠IL-1β、IL-6、RIP3、TNF-α。聚偏二氟乙烯膜轉(zhuǎn)膜后5%脫脂牛奶封閉過(guò)夜。一抗室溫孵育2 h，0.1% PBST 洗膜10 min×3 次。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育1 h，0.1% PBST 洗膜10 min ×3次。ECL 顯影，Gel-pro analyzer 軟件分析灰度值，以GAPDH 為定量標(biāo)準(zhǔn)算出相對(duì)灰度值。

1.7 免疫組化 結(jié)腸組織切片常規(guī)脫蠟，0.01 mol/L檸檬酸緩沖液(pH=6.0)熱修復(fù)抗原，PBS(pH=7.4)洗滌5 min×3 次。3% H2O2孵育15 min 滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS 洗滌5 min×3 次。5% BSA 37 ℃封閉30 min，Anti-RIP3(1 ∶1 600)4 ℃過(guò)夜，PBS 洗滌5 min×3 次，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗37 ℃孵育30 min，PBS 洗片5 min ×3 次，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，逐級(jí)脫水，透明，中性樹(shù)膠封固。

免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果按照參考文獻(xiàn)［5］判定。按著色程度:基本未著色，染色與背景相似者為0 分;著色淺，略高于背景者為1 分;中度著色，明顯高于背景者為2 分;強(qiáng)染，著色深者為3 分。按陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量:陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜25% 為0 分，25% ～50% 為1 分，51% ～75%為2 分，＞75%為3 分。綜合染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量積分相乘為總得分。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用±s 表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 模型組小鼠出現(xiàn)體質(zhì)量下降、腹瀉與便血現(xiàn)象，DAI 顯著高于正常組。在第7 天處死小鼠，取出結(jié)腸后測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度，結(jié)果顯示模型組結(jié)腸長(zhǎng)度為(5.49 ±0.54)cm，較正常組(6.68 ±0.47)cm 明顯縮短(P ＜0.001，見(jiàn)圖1)。

圖1 小鼠DAI 與結(jié)腸長(zhǎng)度 A:各組小鼠DAI;B:正常組結(jié)腸長(zhǎng)度;C:模型組結(jié)腸長(zhǎng)度Fig 1 DAI and colon length A:DAI;B:colon length of normal group;C:colon length of model group

2.2 結(jié)腸病理學(xué)評(píng)分 結(jié)腸HE 染色，光鏡下觀察結(jié)腸病理切片，模型組小鼠結(jié)腸主要表現(xiàn)為炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、隱窩破壞、潰瘍形成、上皮異型性增生(見(jiàn)圖2)。模型組結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分為13.83 ±2.40，較正常組(1.00 ±0.63)顯著升高(P ＜0.001)。

2.3 Western blotting 檢測(cè)各組小鼠結(jié)腸組織中IL-1β、IL-6 的表達(dá) 從結(jié)腸組織提取蛋白用于Western blotting 檢測(cè)IL-1β、IL-6 的表達(dá)。Western blotting 結(jié)果提示模型組小鼠結(jié)腸IL-1β、IL-6 的表達(dá)較正常組顯著增高(見(jiàn)圖3)?；叶确治鼋Y(jié)果顯示模型組小鼠結(jié)腸IL-1β、IL-6 的相對(duì)灰度值分別為6.14 ±0.97、0.62 ±0.12，正常組IL-1β、IL-6 的相對(duì)灰度值分別為3.55 ±1.14、0.29 ±0.07，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

2.4 各組小鼠結(jié)腸組織中RIP3、TNF-α 的表達(dá)

2.4.1 RIP3、TNF-α 的表達(dá):Western blotting 結(jié)果提示在模型組小鼠結(jié)腸組織中RIP3、TNF-α 的表達(dá)量較正常組明顯上升(見(jiàn)圖4)?；叶确治鼋Y(jié)果提示模型組RIP3、TNF-α 的相對(duì)灰度值分別為5. 39 ± 1. 34、0.64 ±0.15，正常組分別為2.55 ±0.72、0.18 ±0.07，兩組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

圖2 小鼠結(jié)腸組織HE 染色(200 ×) A:正常組;B:模型組Fig 2 Mice colon HE staining (200 ×) A:normal group;B:model group

圖3 小鼠結(jié)腸中IL-1β、IL-6 的表達(dá) 1:正常組;2:模型組Fig 3 Expressions of IL-1β，IL-6 in mice colons 1:normal group;2:model group

圖4 小鼠結(jié)腸中RIP3、TNF-α 的表達(dá) 1:正常組;2:模型組Fig 4 Expressions of RIP3，TNF-α in mice colons 1:normal group;2:model group

2.4.2 RIP3 在結(jié)腸組織中的表達(dá)位置:免疫組化染色結(jié)果提示RIP3 表達(dá)的位置主要為結(jié)腸上皮細(xì)胞(見(jiàn)圖5)。模型組結(jié)腸組織RIP3 表達(dá)為4.40 ±1.67，較正常組(1.40 ±0.55)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

圖5 小鼠結(jié)腸組織RIP3 免疫組化染色(400 ×) A:正常組;B:模型組Fig 5 Expression of RIP3 in mice colons by immunohistochemistry-paraffin A:normal group;B:model group

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎被認(rèn)為是一種結(jié)腸非特異性疾病，其病因和發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，大多數(shù)研究認(rèn)為與結(jié)腸上皮的免疫紊亂有關(guān)［6］。腸黏膜屏障主要由腸上皮細(xì)胞構(gòu)成，它在預(yù)防病菌和毒素由腸腔侵入機(jī)體方面發(fā)揮著重要作用［7］。因此，腸上皮細(xì)胞過(guò)度死亡將導(dǎo)致腸黏膜屏障功能障礙，如杯狀細(xì)胞的死亡導(dǎo)致了黏蛋白分泌減少，結(jié)腸化學(xué)屏障被破壞［8］。當(dāng)正常結(jié)腸黏膜屏障被破壞后，多種致病因子直接作用于結(jié)腸導(dǎo)致結(jié)腸炎癥，但是結(jié)腸上皮細(xì)胞的死亡機(jī)制目前尚不明確。

程序性細(xì)胞死亡在維持機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用，這種細(xì)胞死亡目前分為細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死兩種方式［9］，其中前者主要表現(xiàn)為凋亡小體的形成［10］，后者主要表現(xiàn)為:細(xì)胞器的腫脹、胞膜的破裂、炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生［9］。最近發(fā)現(xiàn)的RIP3 是RIP 蛋白家族的一員，在TNF-α 調(diào)控程序性細(xì)胞壞死的過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用［2，11-12］。RIP3 可以活化細(xì)胞能量代謝途徑中的關(guān)鍵性酶(谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脫氫酶-1、糖原磷酸化酶)，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞中活性氧的產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生程序性細(xì)胞壞死［11］。有研究［2］發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞凋亡被抑制時(shí)，細(xì)胞死亡方式為RIP3 介導(dǎo)的程序性細(xì)胞壞死;在小鼠胰腺炎模型中，模型組胰腺組織RIP3 的表達(dá)量較正常組顯著升高，同時(shí)RIP3 基因敲除鼠的胰腺炎癥反應(yīng)輕于野生型鼠，因此，RIP3 參與的程序性細(xì)胞壞死在小鼠胰腺炎中發(fā)揮著重要作用。但是，在小鼠結(jié)腸炎中是否存在RIP3 參與的程序性細(xì)胞壞死目前還尚不明確。

為研究程序性細(xì)胞壞死在結(jié)腸炎中的作用，我們應(yīng)用DSS 建立小鼠結(jié)腸炎模型，該結(jié)腸炎模型在臨床表現(xiàn)和病理學(xué)改變上更加接近于人類的潰瘍性結(jié)腸炎［13］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:模型組小鼠出現(xiàn)體質(zhì)量下降、腹瀉與便血的現(xiàn)象;結(jié)腸HE 染色證實(shí)了小鼠結(jié)腸存在炎癥性改變;炎癥因子IL-1β、IL-6 的表達(dá)也顯著上升。通過(guò)對(duì)小鼠結(jié)腸組織的Western blotting 定量分析，我們發(fā)現(xiàn)模型組小鼠結(jié)腸組織RIP3 表達(dá)量上升，同時(shí)作為RIP3 上游因子TNF-α 的表達(dá)水平也升高。所以，我們認(rèn)為在小鼠結(jié)腸炎中存在程序性細(xì)胞壞死的現(xiàn)象。而在小鼠結(jié)腸組織RIP3 免疫組化染色中，我們發(fā)現(xiàn)RIP3 主要表達(dá)在結(jié)腸上皮細(xì)胞中。因此，結(jié)合Western blotting 與免疫組化結(jié)果，我們認(rèn)為在模型組小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞內(nèi)存在著TNF-α/RIP3 信號(hào)通路介導(dǎo)的程序性細(xì)胞壞死，過(guò)多的細(xì)胞壞死破壞了正常結(jié)腸黏膜屏障，進(jìn)而導(dǎo)致結(jié)腸炎癥。

綜上所述，本研究在動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)了TNF-α/RIP3 信號(hào)通路介導(dǎo)的程序性細(xì)胞壞死在小鼠結(jié)腸炎中發(fā)揮的作用，為潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制與治療靶點(diǎn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］ Kaser A，Zeissig S，Blumberg RS. Inflammatory bowel disease［J］.Annu Rev Immunol，2010，28:573-621.

［2］ He S，Wang L，Miao L，et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha［J］. Cell，2009，137(6):1100-1111.

［3］ Per?e M，Cerar A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model:traps and tricks［J］. J Biomed Biotechnol，2012，2012:718617.

［4］ Sann H，Erichsen Jv，Hessmann M，et al. Efficacy of drugs used in the treatment of IBD and combinations thereof in acute DSS-induced colitis in mice［J］. Life Sci，2013，92(12):708-718.

［5］ Dou XT，Zheng HM，Zheng P. Preliminary study on 5-aminosalicylic acid in a mouse model of colitis-associated carcinoma［J］. Chin J Dig，2012，32(10):688-692.竇曉壇，鄭海明，鄭萍. 5-氨基水楊酸在結(jié)腸炎癌變模型小鼠中的初步研究［J］. 中華消化雜志，2012，32(10):688-692.

［6］ Baumgart DC，Carding SR. Inflammatory bowel disease:cause and immunobiology［J］. Lancet，2007，369(9573):1627-1640.

［7］ Gitter AH，Wullstein F，F(xiàn)romm M，et al. Epithelial barrier defects in ulcerative colitis:characterization and quantification by electrophysiological imaging［J］. Gastroenterology，2001，121(6):1320-1328.

［8］ Johansson ME，Gustafsson JK，Holmén-Larsson J，et al. Bacteria penetrate the normally impenetrable inner colon mucus layer in both murine colitis models and patients with ulcerative colitis［J］. Gut，2014，63(2):281-291.

［9］ Festjens N，Vanden Berghe T，Vandenabeele P. Necrosis，a well-orchestrated form of cell demise:signalling cascades，important mediators and concomitant immune response［J］. Biochim Biophys Acta，2006，1757(9-10):1371-1387.

［10］ Kerr JF，Wyllie AH，Currie AR. Apoptosis:a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics［J］. Br J Cancer，1972，26(4):239-257.

［11］ Vandenabeele P，Declercq W，Van Herreweghe F，et al. The role of the kinases RIP1 and RIP3 in TNF-induced necrosis［J］. Sci Signal，2010，3(115):re4.

［12］ Declercq W，Vanden Berghe T，Vandenabeele P. RIP kinases at the crossroads of cell death and survival［J］. Cell，2009，138(2):229-232.

［13］ Wen HZ，Hao WW，Li J，et al. Factors influencing the development of animal models of dextran sulphatesodium induced colitis ［J］.World Chinese Journal of Digestology，2005，10:3665.溫紅珠，郝微微，李佳，等. 葡聚糖硫酸鈉結(jié)腸炎模型影響因素的研究進(jìn)展［J］. 世界華人消化雜志，2005，10:3665.