非酒精性脂肪性肝病腸源性內毒素血癥形成機理及其作用

王書會，韓繼武

哈爾濱醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院消化內科，黑龍江 哈爾濱150001

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種由于肝細胞內的脂質積累太多引起肝細胞損傷、間質炎癥和纖維化的臨床病理綜合征。其常與中心性肥胖、高血壓、高血脂及2 型糖尿病相伴行［1-2］。研究［3］結果表明:很多肝臟相關疾病患者(肝癌、急慢性肝炎等)都伴有腸源性內毒素血癥(intestinal endotoxemia，IETM)。但近年來一些研究表明，腸道環(huán)境的變化和IETM 可能參與上述疾?。?-5］，本研究通過高脂飼料喂養(yǎng)大鼠，建立NAFLD 模型，探討大鼠NAFLD 導致IETM 的機制及IETM 在NAFLD 中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 成年雄性Wistar 大鼠50 只，體質量150 ～250 g，購自青島派特福德白鼠公司。檢測巨噬細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)試劑盒購自美國Santa Cruz 公司。所有生化試劑購自BECHMAN 公司。

1.2 NAFLD 模型的建立 取動物適應性喂養(yǎng)7 d。50 只大鼠隨機分為正常組和實驗組，每組25 只。正常組采取普通飼料喂養(yǎng)，實驗組采取高脂飼料(81.3%普通飼料、10%豬油、2%膽固醇、0.2%甲基硫氧嘧啶和0.5%膽鹽)喂養(yǎng)。兩組大鼠分別喂養(yǎng)56 d，各取5 只大鼠解剖，取肝組織行病理學檢查。輕度脂肪肝:低倍鏡下肝細胞脂肪變占肝小葉1/3 ～1/2;中度脂肪肝:占肝小葉1/2 ～3/4;重度脂肪肝:占肝小葉3/4 以上或肝細胞彌漫性變性呈漁網(wǎng)狀。

1.3 相關指標檢測

1.3.1 血清指標的檢測:大鼠在喂養(yǎng)第16 周經麻醉后，在無菌條件下采集右心室血3 ml，測定C 反應蛋白(c-reactive protein，CRP)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、巨噬細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA)及血漿D-乳酸。切取肝、脾組織、淋巴結和5 cm回腸(取腸內容物)進行細菌培養(yǎng)和脂多糖檢測。并對肝臟和回腸行病理學檢查。

1.3.2 標本檢測:血漿和回腸內容物的內毒素測定:應用鱟試劑反應動濁法;血漿TNF-α 檢測:應用免疫組織化學方法進行檢測;血漿D-乳酸檢測:繪制標準曲線，用分光光度法進行測定;腸道細菌定量培養(yǎng):取0.1 g 回腸內容物加1 ml 0.9% NaCl 溶液，放置在旋渦混合器振蕩成勻漿液，繼而應用0.9% NaCl 溶液連續(xù)10 倍稀釋勻漿液，取稀釋液50 μl 于培養(yǎng)基上進行腸道細菌定量培養(yǎng);用無菌0.9% NaCl 溶液將肝、脾及淋巴結組織沖洗干凈并吸干，取0.1 g 制成10%的組織勻漿液，取50 μl 勻漿液進行細菌培養(yǎng)，方法同上進行腸道細菌移位的觀察。

1.3.3 病理學檢查:將經處理的肝臟組織及空腸組織制成常規(guī)石蠟切片，行蘇木精-伊紅染色(H-E)進行病理學檢測。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用±s 表示，采用t 檢驗，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組大鼠基本情況 兩組大鼠在實驗結束前均無死亡。實驗組大鼠有不同程度的精神萎靡、反應遲鈍及飲食減少等，而正常組大鼠精神和飲食情況均良好。

2.2 兩組大鼠血清LPS、FFA 及NAFLD 相關炎癥介質水平比較 實驗組大鼠血清LPS、FFA、TNF-α、CRP、MCP-1 和血漿D-乳酸水平均明顯高于正常組，兩組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05，見表1)。

表1 兩組血清指標變化的比較(±s)Tab 1 Comparison of serum markers between two groups (±s)

表1 兩組血清指標變化的比較(±s)Tab 1 Comparison of serum markers between two groups (±s)

只數(shù)LPS(U/L)FFA(mmol/L)TNF-α(μg/L)CRP(μg/L)MCP-1(ng/L)血漿D-乳酸(mg/L)正常組 25 0.08 ±0.03 407.41 ±41.16 1.03 ±0.21 1.45 ±0.85 4.82 ±0.43 6.53 ±1.22實驗組 25 0.62 ±0.08 874.93 ±163.41 2.13 ±0.23 3.17 ±0.63 25.32 ±0.45 8.79 ±1.92 t 值 31.6011 13.8718 17.6594 8.1284 164.6812 4.96 74 P 值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.3 兩組大鼠血漿和回腸內毒素水平比較 與正常組比，實驗組大鼠血漿和回腸內毒素水平明顯增多，組間比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05，見表2)。

表2 兩組大鼠血漿和回腸內毒素水平比較(Eu/ml，±s)Tab 2 Comparison of endotoxin in rat plasma and ileal between two groups(Eu/ml，±s)

表2 兩組大鼠血漿和回腸內毒素水平比較(Eu/ml，±s)Tab 2 Comparison of endotoxin in rat plasma and ileal between two groups(Eu/ml，±s)

血漿內毒素 回腸內容物內毒素正常組0.574 ±0.326 3.431 ±1.253實驗組 3.825 ±1.132 8.148 ±2.023 t 值13.7987 9.9113 P 值 ＜0.05 ＜0.05

2.4 肝、脾、淋巴結細菌生長情況 正常組大鼠除在淋巴結中培養(yǎng)出細菌外，其他組織未培養(yǎng)出細菌，細菌移位率為25.23%;實驗組大鼠在所有檢查組織中均培養(yǎng)出細菌，但以淋巴結組織移位率最高，為81.74%，肝組織移位率為53. 67%，脾臟組織移位率為43.94%。經對培養(yǎng)細菌進行革蘭氏染色分析，發(fā)現(xiàn)97%以上細菌為革蘭陰性桿菌，在少數(shù)組織中培養(yǎng)出革蘭陽性腸球菌(見表3)。

表3 腸道細菌培養(yǎng)結果(lg/g，±s)Tab 3 Bacterial culture results (lg/g，±s)

表3 腸道細菌培養(yǎng)結果(lg/g，±s)Tab 3 Bacterial culture results (lg/g，±s)

組別 雙歧桿菌 乳酸桿菌 腸桿菌 腸球菌正常組10.34 ±1.14 9.78 ±0.83 8.78 ±0.87 8.57 ±0.58實驗組 9.23 ±0.85 8.96 ±0.72 11.26 ±1.76 9.63 ±0.67 t 值4.3391 3.7314 6.3159 5.9808 P 值＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.5 肝臟和回腸黏膜改變 光鏡觀察結果:實驗組大鼠肝細胞呈彌漫性大片壞死，中央靜脈和匯管區(qū)炎性細胞浸潤，且肝竇的正常結果也被破壞(見圖1);正常組可見排列整齊的肝細胞，結構完整清晰的肝竇(見圖2);實驗組大鼠腸黏膜上皮細胞變性脫落、變薄，且淋巴細胞增加(見圖3);而正常組回腸黏膜上皮結構完整，排列整齊(見圖4)。

圖1 實驗組肝臟病理變化(HE 200 ×);圖2 正常組肝臟病理變化(HE 200 ×);圖3 實驗組腸黏膜病理變化(HE 200 ×);圖4正常組腸黏膜病理變化(HE 200 ×)Fig 1 Liver pathological changes in the experimental group (HE 200 ×);Fig 2 Liver pathological changes in the normal group(HE 200 ×);Fig 3 Pathological changes of intestinal mucosa in the experimental group (HE 200 ×);Fig 4 Pathological changes of intestinal mucosa in the normal group (HE 200 ×)

3 討論

內毒素主要存在于革蘭氏陰性細菌細胞壁外膜中，主要成分為LPS［6］。在正常情況下，腸道中的內毒素僅有少量被腸道吸收，經門靜脈進入肝臟后迅速被Kupffer 細胞清除。當肝臟功能受到損害時，大量的內毒素不能完全清除，使循環(huán)系統(tǒng)中內毒素濃度增高，此外，腸道屏障功能的破壞致使過量的內毒素發(fā)生移位，最終導致IETM 形成［7-9］。

內毒素可激活腸上皮細胞上的腺苷環(huán)酶，引起腸上皮細胞發(fā)生自溶和變性壞死;內毒素還可以通過激活補體系統(tǒng)、凝血系統(tǒng)和巨噬細胞白介素活化而直接或間接導致腸黏膜屏障損傷［10-11］。研究［12］表明:細菌代謝產物LPS，主要通過對新生腸上皮細胞遷移的抑制和削弱細胞修復因子修復的作用，導致腸黏膜局部破壞，繼而內毒素侵入，觸發(fā)炎癥連鎖反應，最終導致腸缺血壞死，腸屏障功能損害。內毒素不僅對肝細胞有直接損害作用［13］，還可通過激活Kupffer 細胞，促進TNF-α 等細胞因子和炎性介質的釋放，從而使內毒素的作用逐漸放大［14］。在NAFLD 時，產生大量的IL、NO、IFN 等促炎癥細胞因子相互作用致使腸道黏膜屏障功能受損的同時也使得腸上皮細胞通透性增加［15-17］。總之，在NAFLD 形成的過程中，因腸道細菌過度生長和菌群移位等因素導致循環(huán)系統(tǒng)中內毒素增高，從而使肝竇的Kupffer 細胞被激活，使大量炎癥因子及炎癥介質大量合成和釋放，使肝臟損害進一步加重，造成不良循環(huán)，不斷加重疾病的進展，最終使肝臟病變向肝纖維化和肝硬化等方向發(fā)展［18-20］。

本實驗結果表明:造模成功的實驗組大鼠血漿回腸內毒素表達水平較正常組明顯升高，說明已經形成了IETM;腸道細菌培養(yǎng)結果表明，正常的腸道內占絕對優(yōu)勢的細菌為厭氧菌，并對腸道微環(huán)境的維護起重要作用。在NAFLD 時腸道菌群就會出現(xiàn)顯著失調。本實驗檢測回腸內毒素的表達實驗組高于正常組，表明隨著G 陰性腸道桿菌的大量繁殖，腸道內毒素的含量也不斷增加，致使細菌和內毒素發(fā)生移位。實驗組大鼠血漿D-乳酸的表達水平較正常組高，說明實驗組的腸道通透性較正常組明顯增高。同樣病理學檢測結果也表明了實驗組大鼠的腸道黏膜出現(xiàn)了損傷、腸黏膜通透性升高，從而為腸道細菌的移位創(chuàng)造了條件。肝脾組織及淋巴結細菌培養(yǎng)結果顯示正常組在肝脾組織中未見細菌，只在淋巴結中檢測到細菌。然而實驗組大鼠肝脾及淋巴結中均檢測到細菌，經G 染色顯示，檢測的細菌中以G 陰性菌為主，而G 陽性球菌則少見，與腸道菌群相似，充分說明腸道細菌發(fā)生了移位。肝臟病理學檢測所示肝細胞大量壞死，肝竇結構破壞，說明內毒素進入體循環(huán)后直接或間接造成了肝細胞的破壞。IETM 形成后，內毒素即可激活肝內單核細胞系統(tǒng)及Kupffer 細胞釋放大量的促炎癥性介質，其中TNF-α 是最為重要的一個。TNF-α 既可以直接也可以通過微循環(huán)障礙導致肝細胞壞死。它在內毒素刺激下同其他炎癥介質相互作用，爆發(fā)瀑布效應，使肝損害逐漸加重。本實驗結果表明，TNF-α 和血漿內毒素的增加呈正相關，說明內毒素可刺激機體產生和釋放TNF-α，并 通 過TNF-α 誘 導 肝 損 傷。本 實 驗 證 實NAFLD 存在小腸黏膜屏障損傷，內毒素水平明顯升高并形成IETM。

總之，因為IETM 可導致NAFLD 的發(fā)生，所以經腸道著手治療脂肪肝病具有很大的可能性。選擇合適的醫(yī)療方式降低IETM，對預防脂肪性肝病的發(fā)生和進展有著極大意義。

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