辛伐他汀對大鼠門脈高壓性胃病的作用

王華僑，李天明，羅宏武

中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院普通外科，湖南 長沙410013

門脈高壓性胃病(portal hypertensive gastropathy，PHG)是指門脈高壓癥伴發(fā)的胃黏膜非炎癥病變，是上消化道出血的重要原因之一，嚴(yán)重時(shí)危及生命。PHG 的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前認(rèn)為是多因素、多種作用機(jī)制共同參與并相互作用形成的。NO 在PHG的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了關(guān)鍵作用［1］。有研究表明，PHG大鼠模型中胃黏膜組織內(nèi)NO 含量明顯增高［2］。NO由一氧化氮合酶合成，包括組織型一氧化氮合酶(constitutive nitric oxide synthase，cNOS)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)。參與致病的NO 則主要由iNOS 合成［3］。他汀類藥物是3-羥-3-甲基戊二酸單酰輔酶A 還原酶抑制劑，除了其降脂作用外，近年研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物能夠抑制iNOS，減少NO 的產(chǎn)生［4-5］。目前國內(nèi)外尚未見他汀類藥物治療PHG 的相關(guān)報(bào)道，本文擬通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究辛伐他汀對大鼠PHG 的作用并探討其可能機(jī)制，為藥物治療PHG 提供一種新方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器和實(shí)驗(yàn)對象 辛伐他汀購自山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán)賽特有限責(zé)任公司(產(chǎn)品批號:130101);BCA 蛋白濃度測定試劑盒，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;一氧化氮合成酶試劑盒(分型)、一氧化氮測定試劑盒(硝酸還原法)購自南京建成生物工程研究所;健康雄性Wistar 大鼠40 只，SPF 級，體質(zhì)量220 ～250 g，購自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部;組織勻漿機(jī)、MIAS-2000 圖像分析系統(tǒng)、TV-1901雙光束紫外可見光分光光度計(jì)、奧林巴斯BX51 光學(xué)顯微鏡、日立7600 全自動(dòng)生化分析儀由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組和模型制備:健康雄性Wistar 大鼠40 只，隨機(jī)分為假手術(shù)組(SO 組，n =14)、結(jié)扎組(LIG 組，n=14)、辛伐他汀治療組(SVS 組，n =12)。LIG 組和SVS 組造模方法采用門靜脈主干部分結(jié)扎+左腎上腺靜脈結(jié)扎法，2 周后即可形成PHG 大鼠模型［6］。SO 組僅分離門靜脈和左側(cè)腎上腺靜脈及周圍血管而不結(jié)扎，余操作同結(jié)扎組。各實(shí)驗(yàn)組大鼠關(guān)腹術(shù)后5 d 內(nèi)常規(guī)肌注青霉素注射液200 000 U/d。

1.2.2 給藥方法和標(biāo)本采集:造模2 周后對SVS 組大鼠予以辛伐他汀(20 mg/kg)溶于水后灌胃，同時(shí)SO組和LIG 組給予等量生理鹽水，1 次/d，持續(xù)4 周。于造模后2 周從SO 組和LIG 組大鼠中隨機(jī)抽取3 只，測定門靜脈壓力(portal pressure，PP)值。PP 值測定后，處死大鼠完整摘除胃，經(jīng)10%甲醛固定30 min 后，沿胃大彎剪開胃，生理鹽水清洗胃黏膜黏液及血跡，肉眼下觀察胃黏膜損傷程度。

1.2.3 PP 值測定:大鼠經(jīng)乙醚麻醉后沿腹中線進(jìn)腹，切口長約5 cm，找到腸系膜上靜脈與脾靜脈匯合點(diǎn)上方，將一充滿肝素鈉生理鹽水的5 號靜脈輸液套管針逆行穿刺刺入門靜脈，然后拔出針芯。固定套管針后，以大鼠右心房為“0”點(diǎn)測量門靜脈壓力，PP 值＞16 cm H2O 可診斷為大鼠門脈高壓癥［7］。

1.2.4 胃黏膜形態(tài)學(xué)觀察:給藥4 周后，處死并采集各組大鼠胃黏膜，采集方法同前，分別在肉眼和光學(xué)顯微鏡下觀察胃黏膜損傷程度。另外取部分胃底組織于甲醛液中固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)4 μm 切片行HE染色，其余標(biāo)本液氮凍存。

1.2.5 黏膜下層毛細(xì)血管面積和最大直徑測定:光學(xué)顯微鏡下對胃底組織HE 染色切片，應(yīng)用計(jì)算機(jī)輔助圖像分析系統(tǒng)檢測和統(tǒng)計(jì)黏膜下毛細(xì)血管面積和最大直徑［8］。每張切片各隨機(jī)選擇5 個(gè)視野(100)測定胃底黏膜下血管最大直徑和面積，結(jié)果取其平均值。

1.2.6 胃黏膜組織iNOS、cNOS 活性及NO 含量測定:取出液氮凍存標(biāo)本并復(fù)溫，分析天平稱取0.2 g胃底組織，于冰鹽水洗凈血跡。加入生理鹽水制備重量體積比為10%組織勻漿，高速冷凍離心機(jī)4 000 r/min離心10 min，保留上清液棄去沉淀，取部分上清液用BCA 法測定蛋白質(zhì)含量。其余部分用于cNOS、iNOS活性和NO 濃度的測定。測定方法依據(jù)一氧化氮合成酶試劑盒(分型)及一氧化氮測定試劑盒(硝酸還原法)說明書操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以±s 表示，符合正態(tài)分布資料采用單因素方差分析(ANOVA)檢驗(yàn);若為非正態(tài)分布資料則采用Games-Howell 檢驗(yàn)。P ＜0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模情況 大鼠經(jīng)造?；蚣偈中g(shù)后，術(shù)后前2 d狀態(tài)欠佳，活動(dòng)量及進(jìn)食量較少，3 d 后恢復(fù)正?；顒?dòng)和飲食。LIG 組大鼠造模術(shù)后死亡1 只，考慮為手術(shù)操作時(shí)間較長，麻醉過深所致。SVS 組大鼠在辛伐他汀灌胃期間死亡1 只，為灌胃數(shù)分鐘內(nèi)死亡，考慮為藥物誤入氣管窒息所致。造模后第2 周測定結(jié)果SO 組大鼠PP 值分別為10. 4 cmH2O、10. 7 cmH2O 和11.2 cmH2O，LIG 組大鼠PP 值分別為23.3 cmH2O、23.1 cmH2O 和24.2 cmH2O。胃大體標(biāo)本可見SO 組大鼠胃黏膜皺襞光滑，無黏膜充血水腫及出血點(diǎn)、糜爛及壞死;LIG 組大鼠胃黏膜充血水腫及廣泛糜爛、出血點(diǎn)(見圖1)，提示造模成功。

2.2 PP 值 LIG 組大鼠平均PP 值(24.26 ± 2.14)cmH2O 較SO 組(10.35 ± 1.32)cmH2O 顯著增加(P ＜0.01)，SVS 組的平均PP 值(18.33 ± 2.11)cmH2O 較LIG 組明顯下降(P ＜0. 01)，但仍高于SO 組(P ＜0.01)。

2.3 胃黏膜形態(tài)學(xué)觀察 大鼠處死后，胃大體形態(tài)觀察可見SO 組大鼠胃黏膜光滑，未見散在出血點(diǎn)、黏膜下充血水腫及毛細(xì)血管擴(kuò)張;LIG 組大鼠可見廣泛胃黏膜充血、糜爛，局部小潰瘍形成伴點(diǎn)狀出血;SVS組以上病變較LIG 組減輕(見圖2);HE 染色可見LIG組黏膜上皮細(xì)胞脫落，毛細(xì)血管迂曲擴(kuò)張，充血明顯，黏膜下層水腫增厚;SVS 組病變較LIG 組緩解(見圖3)。

圖1 造模2 周胃大體標(biāo)本 A:SO 組;B:LIG 組Fig 1 Gross morphology of gastric mucosa of rats after modeling for 2 weeks A:SO group;B:LIG group

圖2 各組大鼠胃黏膜大體形態(tài) A:SO 組;B:LIG 組;C:SVS 組Fig 2 Gross morphology of gastric mucosa of rats in different groups A:SO group;B:LIG group;C:SVS group

注:箭頭所示為黏膜下血管。圖3 各組大鼠胃黏膜HE 染色(100 ×) A:SO 組;B:LIG 組;C:SVS 組Fig 3 HE stain of gastric mucosa of rats in different groups (100 ×) A:SO group;B:LIG group;C:SVS group

2.4 藥物對胃黏膜下血管的影響 LIG 組黏膜下毛細(xì)血管面積和最大直徑較SO 組明顯增多(P ＜0.01)，SVS 組黏膜下毛細(xì)血管面積和最大直徑較LIG 組減少(P ＜0.01)，但仍高于SO 組(P ＜0.01，見表1)。

表1 各組大鼠胃黏膜下層血管面積、最大直徑比較(±s)Tab 1 Comparison of the area and maximum diameter of gastric mucosal capillaries of rats in each group (±s)

表1 各組大鼠胃黏膜下層血管面積、最大直徑比較(±s)Tab 1 Comparison of the area and maximum diameter of gastric mucosal capillaries of rats in each group (±s)

注:與SO 組比較，★P ＜0.01;與LIG 組比較，▲P ＜0.01 。

SO 組★▲

2.5 胃黏膜組織的iNOS、cNOS 活性測定及NO 含量測定 LIG 組胃壁組織中iNOS 的活性和NO 的含量顯著高于SO 組(P ＜0.01);SVS 組iNOS 的活性和NO 含量明顯低于LIG 組，但仍高于SO 組(P ＜0.01，見表2)。

表2 各組大鼠胃黏膜組織iNOS、cNOS 活性及NO 含量(±s)Tab 2 Constitutive nitric oxide synthase activity，inducible nitric oxide synthase activity and NO content of the gastric mucosal tissue of rats in each group (±s)

表2 各組大鼠胃黏膜組織iNOS、cNOS 活性及NO 含量(±s)Tab 2 Constitutive nitric oxide synthase activity，inducible nitric oxide synthase activity and NO content of the gastric mucosal tissue of rats in each group (±s)

注:與SO 組比較，★P ＜0.01;與LIG 組比較，▲P ＜0.01。

組別 只數(shù)cNOS 活性(U/mg)iNOS 活性(U/mg)NO 含量(μmol/g)11 0.568 ± 0.104 0.106 ± 0.025 0.612 ± 0.106 LIG 組10 0.895 ± 0.113★ 0.712 ± 0.108★ 2.660 ± 0.431★SVS 組11 0.706 ± 0.116★▲0.332 ± 0.084★▲1.686 ± 0.145 SO 組★▲

3 討論

PHG 表現(xiàn)為胃黏膜淤血、水腫和糜爛，呈馬賽克或蛇皮樣改變。目前研究認(rèn)為NO 參與了PHG 的形成［1］。NO 的強(qiáng)力擴(kuò)張血管作用引起胃黏膜微循環(huán)障礙并作為自由基引發(fā)脂質(zhì)過氧化損傷胃黏膜。cNOS合成生理狀態(tài)的NO，調(diào)節(jié)各種生理功能;iNOS 在生理狀態(tài)不表達(dá)，受到如TNF-α、內(nèi)毒素等刺激時(shí)大量合成非生理濃度的NO，對細(xì)胞產(chǎn)生損害作用。門靜脈高壓所致門-體分流引起內(nèi)毒素血癥，刺激TNF-α、IFNγ、ET-1 等細(xì)胞因子大量產(chǎn)生，可刺激胃黏膜iNOS 的表達(dá)及活性明顯增強(qiáng)［3］，使局部NO 合成增加，形成惡性循環(huán)。另外，過量NO 還可破壞胃黏膜的防御機(jī)制［9］。

他汀類藥物具有諸多非降脂作用。研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物可抑制iNOS，減少NO 生成［4-5］，明顯降低TNF-α 和IFN-γ 誘導(dǎo)的iNOS 的水平［10］;抑制血小板的黏附與聚集，預(yù)防心血管血栓形成，其機(jī)制可能與其上調(diào)cNOS mRNA 表達(dá)，增加NO 含量有關(guān)［11］;保持內(nèi)皮細(xì)胞表面光滑完整，調(diào)節(jié)微循環(huán)及白細(xì)胞相互作用［12］;顯著降低內(nèi)毒素休克大鼠血漿過量的NO，恢復(fù)血管反應(yīng)性［13］。本研究表明，與SO 組相比，LIG 組大鼠PP 值、胃黏膜病變、胃黏膜組織內(nèi)iNOS 活性及NO含量均出現(xiàn)明顯的增高，提示iNOS 過度激活，NO 大量產(chǎn)生，并對胃黏膜產(chǎn)生了明顯的損傷作用，與以往報(bào)道一致［14-15］。SVS 組與LIG 組比較，各項(xiàng)指標(biāo)均有不同程度改善，胃黏膜組織iNOS 活性及NO 的含量均下降明顯，表明辛伐他汀對大鼠PHG 有治療作用，其機(jī)制與降低胃黏膜iNOS 活性、減少NO 的過量產(chǎn)生有關(guān)。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，LIG 組cNOS 活性較SO 組明顯增加，這是機(jī)體對損傷因素的一種自我保護(hù)機(jī)制。SVS 組iNOS 活性及NO 的含量下降后，cNOS 活性也伴有不同程度降低，提示機(jī)體可根據(jù)損傷因素強(qiáng)弱程度自主調(diào)節(jié)cNOS 活性，使其在新的狀態(tài)下達(dá)到平衡。在本研究中，與SO 組相比，LIG 組的iNOS 活性增高約6 倍，cNOS 僅增高約50%，LIG 組cNOS 和iNOS 活性相對比例失衡，使破壞因素相對增強(qiáng)，加重了胃黏膜損傷;而給予辛伐他汀治療后，則在一定程度上糾正了這種失衡。另外，iNOS 催化合成NO 的能力較cNOS大，但當(dāng)cNOS 催化合成的微量NO 上調(diào)，則有利于內(nèi)皮功能的恢復(fù)［16］，由此推測cNOS 和iNOS 及其相應(yīng)產(chǎn)物可能通過不同的代謝途徑和作用機(jī)制參與細(xì)胞病理生理過程。SVS 組各測量指標(biāo)尚未完全恢復(fù)正常，一方面提示PHG 病變是由多因素、多種發(fā)病機(jī)制共同作用形成的，NO 含量、iNOS 活性的增加及cNOS 和iNOS 活性相對比例的失衡在PHG 發(fā)病中發(fā)揮了重要作用，但并非唯一因素;另一方面可能與辛伐他汀給藥時(shí)間過短有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

總之，本研究表明辛伐他汀對PHG 模型大鼠胃黏膜具有一定保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過降低胃黏膜iNOS 活性、減少NO 的過量產(chǎn)生及恢復(fù)iNOS 與cNOS活性的相對平衡有關(guān)。

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