聚氰基丙烯酸正丁酯熒光納米微球的制備及其在小鼠體內(nèi)分布情況研究

李春梅，張 林，侯艷紅，李 楠

1.解放軍第309 醫(yī)院消化科，北京100091;2.河北北方學(xué)院

α-氰基丙烯酸正丁酯(butylcyanoacrylate，BCA)早期主要用做醫(yī)用膠、組織粘合劑、醫(yī)用材料等，具有組織、血液、免疫等生物兼容性。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)利用聚合反應(yīng)制備的聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒子(polybutylcyanoacrylate nanoparticles，PBCA-NPs)可吸附、包裹藥物，不但對藥物有靶向傳輸功能，還能起到緩釋作用，從而提高藥物的療效并減少對機(jī)體的毒副作用，因此在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中具有更為廣泛的應(yīng)用前景。前期國內(nèi)已有學(xué)者對PBCA-NPs 在生物體內(nèi)的分布情況進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)靜脈用藥后主要分布于肝、肺、脾等組織［1-2］。大多學(xué)者［3-4］通過檢測藥物在各組織中的濃度來確定載藥納米粒子的組織分布情況，最近，部分研究者［5-7］通過活體成像的方法觀察納米粒子在體內(nèi)代謝。而不同粒徑PBCA-NPs 對器官組織分布情況的影響及在組織中代謝速度的研究相對匱乏。以上情況均提示本研究的必要性和可行性。

吲哚菁綠(indocyanine green，ICG)是目前被美國食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)的用于醫(yī)療臨床使用的花青染料，廣泛應(yīng)用于光動力治療［8］、生物醫(yī)學(xué)成像［9］、腫瘤檢測［10］及腦血管毒性評價［11］等方面。本研究中利用ICG 在近紅外光譜范圍內(nèi)的較強(qiáng)吸收和熒光特性將其包埋于PBCA-NPs，從而實現(xiàn)納米粒子生物體內(nèi)的顯像示蹤，并成功制備出不同納米粒徑的ICG-PBCA-NPs，就PBCA-NPs 納米粒徑對于其生物體內(nèi)組織中的分布及代謝影響進(jìn)行研究。從而為納米粒子靶向運輸?shù)呐R床應(yīng)用提供有效支持。

1 材料與方法

1.1 材料 α-氰基丙烯酸正丁酯(BCA，北京瞬康醫(yī)用膠有限公司);吲哚菁綠(ICG，上海晶純生化科技股份有限公司);Dextran70(德國BASF 公司);ICG-PBCA-NPs(自制，含量:0.5 mg/ml);抗熒光淬滅封片液(P0126，碧云天生物技術(shù)研究所);其他試劑為國產(chǎn)分析純。實驗儀器包括85-2 恒溫加熱磁力攪拌器(上海志威電器有限公司);微孔濾膜(欣惠澤奧有限公司)，IX71 熒光顯微鏡(日本Olympus 公司);RF-5301PC 熒光分光光度計(日本島津公司)。健康雄性昆明小鼠體質(zhì)量(28 ±3)g，由中國人民解放軍309 醫(yī)院結(jié)核研究所動物實驗室提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 ICG-PBCA-NPs 的制備:通過控制乳化聚合過程中的溫度、pH 值、攪拌速度、穩(wěn)定劑及原料的用量等條件制備粒徑為20、50、100、150、200 nm 左右的ICGPBCA-NPs。取BCA 適量溶解于丙酮中作為有機(jī)相(溶液Ⅱ);將Dextran70 及ICG 用蒸餾水溶解后作為水相(溶液Ⅰ)，并用0.1 mol/L 的HCl 調(diào)pH 值。室溫條件下一定轉(zhuǎn)速磁力攪拌，按一定比例將有機(jī)相緩緩加入水相中，繼續(xù)磁力攪拌3 h 至有機(jī)溶劑揮盡，用0.1 mol/L NaOH 水溶液調(diào)節(jié)體系的pH=7.0，繼續(xù)攪拌0.5 h，利用微孔濾膜過濾溶液后低溫靜置，即可得到乳白色I(xiàn)CG-PBCA-NPs 微球膠體溶液。

1.2.2 ICG 于各組織中濃度測量:ICG 2 mg 溶于0.1 mol/L PBS 2 ml 中配成1 000 μg/ml ICG 標(biāo)準(zhǔn)原液，以PBS為溶劑配制ICG 梯度稀釋液，選擇805 nm 波長進(jìn)行熒光定量實驗，以ICG 濃度為橫坐標(biāo)，A 值為縱坐標(biāo)，繪制ICG 溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線。取昆明種小鼠隨機(jī)分為6組:(25.0 ±7. 6)nm ICG-PBCA-NPs 組(第1 組);(49.0 ±8.6)nm ICG-PBCA-NPs 組(第2 組);(88.0 ±20.5)nm ICG-PBCA-NPs 組(第3 組);(145.0 ±13.5)nm ICG-PBCA-NPs 組(第4 組);(205. 0 ± 8. 4)nm ICG-PBCA-NPs 組(第5 組);空白對照組(第6 組)。1 ～5 組每只小鼠分別注射ICG-PBCA-NPs 溶液(10 mg/kg)，空白組注射等量生理鹽水，均經(jīng)尾靜脈注射。分別于注射0.5、1、5、12 h 后行頸椎脫臼各處死3 只小鼠，取心、肝、脾、腎、胰等臟器，于組織勻漿器制成組織勻漿，4 ℃過夜，離心(8 000 r/min，10 min，離心半徑10 cm)，應(yīng)用熒光分光光度計測定ICG 的A 值，根據(jù)ICG 溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出各臟器中含ICG 的量。將每組3 只平行動物所對應(yīng)的ICG 的量取均值。1.2.3 熒光納米粒子于小鼠體內(nèi)的熒光顯像:將以上每組分別于注射0.5、1、5、12 h 后分離得到的心、肝、脾、腎、胰用生理鹽水洗凈后用濾紙吸干多余水分，各組織切成1 cm×1 cm×0.3 cm 大小的組織塊，迅速放入液氮中冷凍保存。將冰凍組織裝于切片機(jī)固定器上夾緊進(jìn)行切片，將組織切片貼于載玻片用P0126 封片，置于倒置熒光顯微鏡下觀察組織熒光微球分布情況，并拍照記錄。

2 結(jié)果

2.1 乳化聚合法合成熒光納米粒子 通過乳化聚合法在去離子水中制備ICG-PBCA-NPs。調(diào)控制作過程中pH 值、攪拌速度、Dextran70 質(zhì)量濃度、α-氰基丙烯酸正丁酯質(zhì)量濃度，成功制得(25.0 ±7.6)nm、(49.0 ±8.6)nm、(88.0±20.5)nm、(145.0±13.5)nm、(205.0±8.4)nm 5 種粒徑ICG-PBCA-NPs。避光室溫條件下保存2 ～3個月，用蒸餾水溶解后可見納米粒子具有較好的分散性，其形態(tài)、大小基本沒有變化。

2.2 熒光納米粒子在小鼠體內(nèi)的分布及代謝

2.2.1 ICG 于各組織中濃度測量:ICG 溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1 所示。對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y =1.0365x +0.7219，R2= 0.9957(x 代表ICG 濃度，y 代表吸光度，R 為精確度)。根據(jù)各組織中ICG 的A 值計算出組織中ICG 的量。第6 組于波長805 nm 下測量的各臟器熒光強(qiáng)度結(jié)果均非常弱，因此暫將其對ICG 的熒光結(jié)果造成的干擾忽略。(25.0 ±7.6)nm ICG-PBCA-NPs組于小鼠各組織器官中均未見明顯分布。肝、脾是ICG-PBCA-NPs 的主要聚集臟器，肝臟、脾臟于納米粒徑為(145.0 ±13.5)nm 時熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，但隨著ICGPBCA-NPs 納米粒徑的減小，其于肝、脾中的熒光強(qiáng)度減弱。隨著納米粒子粒徑的減少，在腎臟熒光強(qiáng)度略有增強(qiáng)，但變化不明顯。心臟于各納米粒徑各時間點ICG-PBCA-NPs 分布均較少或無。胰腺組織中熒光濃度隨著納米粒子粒徑的減小逐漸增強(qiáng)，于(49. 0 ±8.6)nm 組注射1 h 出現(xiàn)最高濃度，并且各時段胰腺組織熒光強(qiáng)度于(49.0 ±8.6)nm 粒子組明顯強(qiáng)于(88.0±20.5)nm、(145.0 ±13.5)nm、(205.0 ±8.4)nm 組。心、肝、脾、腎、胰腺于各組出現(xiàn)的最強(qiáng)熒光濃度繪制成折線圖，如圖2 所示。

圖1 ICG 濃度與A 值的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 1 The standard curve of ICG concentration and A value

圖2 小鼠各臟器在不同粒徑下的最強(qiáng)濃度曲線Fig 2 The strongest fluorescence distribution of different diameter nanoparticles in mice

2.2.2 熒光納米粒子于小鼠體內(nèi)的熒光顯像:分別于0.5、1、5、12 h 將各組小鼠解剖，采集心、肝、脾、腎、胰等器官組織制作冰凍切片，在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。其結(jié)果與ICG 于各組織中濃度測量結(jié)果基本吻合。熒光顯微鏡下獲得的心、肝、脾、腎、胰所對應(yīng)的最強(qiáng)熒光如圖3 所示。

圖3 熒光顯微鏡下心、肝、脾、腎、胰最強(qiáng)熒光圖(400 ×) A:心臟最強(qiáng)熒光圖;B:肝臟最強(qiáng)熒光圖;C:脾臟最強(qiáng)熒光圖;D:腎臟最強(qiáng)熒光圖;E:胰腺最強(qiáng)熒光圖Fig 3 The strongest fluorescences of heart，liver，spleen，kidney and pancreas under the fluorescencemicroscope (400 ×) A:the strongest fluorescence in heart;B:the strongest fluorescence in liver;C:the strongest fluorescence in spleen;D:the strongestfluorescence in kidney;E:the strongest fluorescence in pancreas

3 討論

聚氰基丙烯酸正丁酯是一種無毒、分子量小、生物相容性較好、可生物降解的高分子納米材料。本實驗采用氰基丙烯酸正丁酯為聚合單體，通過乳化聚合法制備可生物降解的PBCA-NPs，并將ICG 包載其中達(dá)到成功熒光顯像作用。鑒于水中OH-可引發(fā)BCA 單體之間發(fā)生親核反應(yīng)而聚合，因此，通過調(diào)節(jié)pH 值可以調(diào)控氰基丙烯酸酯的聚合，另外制作過程中攪拌速度、相關(guān)原料比例的改變均會影響聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒子的外觀形態(tài)、粒徑大小、分散性等。我們在制作過程中通過調(diào)控pH 值、攪拌速度、相關(guān)原料比例、穩(wěn)定劑類型成功制備出不同粒徑ICG-PBCA-NPs，其中粒徑最小的納米粒子是(25.0 ±7.6)nm。最終將不同粒徑的納米粒子按照分組通過尾靜脈注射于小鼠體內(nèi)，在不同時間點處死小鼠，解剖小鼠取其心、肝、脾、腎、胰腺組織各臟器于組織勻漿器中制成組織勻漿，離心后利用分光光度計測定各組織中熒光強(qiáng)度;同時于對應(yīng)時間點將各臟器制作冰凍切片并獲得熒光圖片，觀察不同粒徑ICG-PBCA-NPs 于不同時間點在小鼠體內(nèi)各重要臟器代謝過程。將直觀觀察和熒光強(qiáng)度量化結(jié)合起來綜合評估不同粒徑PBCA-NPs 在各組織中的分布情況。

實驗結(jié)果顯示不同粒徑納米粒子在不同組織分布明顯不同，大粒徑主要于肝、脾組織聚集，隨著粒徑減小，納米粒子體內(nèi)重新分布，在肝、脾分布減少，而胰腺、腎臟的分布略增多，心臟分布增加不明顯。肝臟、脾臟最具靶向性的納米粒徑為(145.0 ±13.5)nm，因其較其他各組在肝臟組織的熒光強(qiáng)度均強(qiáng)。這與粒徑為100 ～200 nm 時易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)的巨噬細(xì)胞內(nèi)吞轉(zhuǎn)運至Kupffer 細(xì)胞，從而在肝、脾等部位明顯聚集的研究結(jié)果相吻合［1］。而胰腺中(49.0 ±8.6)nm組其熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于其他粒徑在胰腺中的分布，說明(49.0 ±8.6)nm 可能是胰腺最適粒徑大小。這可能與＜100 nm 的粒子可逃脫RES 的識別，在體內(nèi)實現(xiàn)重新分布，且粒徑＜50 nm 時納米?？梢源┻^肝臟，從而使得PBCA-NPs 于其他器官組織中分布增多有關(guān)［12］。(25.0 ±7.6)nm 組在各組織中的熒光強(qiáng)度均較弱或幾乎沒有，這可能是因為納米粒子粒徑越小網(wǎng)狀內(nèi)皮吞噬系統(tǒng)越難識別，同時由于粒徑太小易透過腎小球基膜而使藥物過快地清除，而有相關(guān)報道認(rèn)為＜(48. 0 ±9. 2)nm 組的微?？蛇M(jìn)入骨髓，且粒徑越小越容易進(jìn)入骨髓［13］，還需我們進(jìn)一步實驗加以驗證。納米粒徑的大小不但影響ICGPBCA-NPs 在小鼠體內(nèi)的分布，還影響其代謝時間。肝臟、脾臟于(49.0 ±8.6)nm 組最強(qiáng)熒光發(fā)生的時間(1 h)明顯早于(88.0 ±20.5)nm、(145.0 ±13.5)nm 組、(205.0 ±8.4)nm 組(5 h)，說明隨著納米粒子減小，其在小鼠體內(nèi)停留時間相對縮短。以上研究結(jié)果與我國學(xué)者申方良等［2］的研究結(jié)果基本吻合。他們就阿霉素聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒粒徑與肝靶向性的關(guān)系進(jìn)行研究，應(yīng)用高效液相色譜法測定納米粒子粒徑大小對小鼠體內(nèi)肝、脾、心、肺、腎組織、血漿內(nèi)阿霉素濃度的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同粒徑在以上組織均有分布。我們的實驗結(jié)果不但呼應(yīng)于以上研究，還檢測了該粒子是否能分布于胰腺組織。對于納米粒子用于胰腺癌的藥物治療有重要意義。

然而本研究尚有明顯不足，如在樣本量選擇上相對較少，增加樣本量后實驗結(jié)果會更具說服力。另外，時間點的選取、粒徑分布的細(xì)化、組織類型的增加均有利于實驗的完善，以上均是我們接下來的研究工作中需要解決的問題。Patra 等［14］將表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)標(biāo)記于載藥納米粒子表面，通過體內(nèi)、體外實驗驗證其靶向治療胰腺癌作用。Valetti 等［15］將CKAAKN 肽與載吉西他濱納米粒子相結(jié)合，利用CKAAKN 肽胰腺癌高識別性，從而對胰腺癌起到靶向治療作用。在以上研究基礎(chǔ)上，結(jié)合本實驗得出的胰腺組織的最適納米粒徑為(49.0 ±8.6)nm，設(shè)想將具有胰腺癌靶向標(biāo)志物標(biāo)記于最適粒徑PBCA-NPs 納米粒子表面，利用其對胰腺癌的特異性識別作用增強(qiáng)其與胰腺組織特異性識別，在此雙重作用下實現(xiàn)胰腺相關(guān)疾病特異無毒高效治療作用，將是一個有前途的研究方向。

綜上所述，利用不同粒徑PBCA-NPs 的組織分布及代謝特征，結(jié)合其可生物降解性及生物相容性高等特點，將其應(yīng)用于臨床研究治療將對未來醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)步產(chǎn)生巨大影響。

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