博落回生物堿成分及其抗菌活性的研究

博落回生物堿成分及其抗菌活性的研究

王朝元1，童勝蘭1，胡鑫2，*

(1中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430074；2 中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢 430074)

摘要為研究罌粟科植物博落回的生物堿成分，采用硅膠柱層析、重結(jié)晶等方法對其進(jìn)行了分離純化，結(jié)果獲得了5個(gè)生物堿，分別經(jīng)波譜分析鑒定為：原阿片堿(I)，pancorine (II)，去甲基白屈菜紅堿 (III)，6-丙酮基二氫血根堿 (IV)， 6-丙酮基二氫白屈菜紅堿(V)，其中化合物 (II)為首次從該植物中分離得到.抗菌圈檢測發(fā)現(xiàn)博落回總生物堿抗菌作用較強(qiáng)，對金黃色葡萄球菌的抑制作用尤為顯著.

關(guān)鍵詞博落回；生物堿；抗菌活性

收稿日期2014-11-20*

作者簡介王朝元(1964-),男,博士,教授,研究方向:生物醫(yī)學(xué)工程,E-mail:wangchaoyuan@mail.scuec.edu.cn

基金項(xiàng)目國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81201610);國家十二五科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目(2012BAI27B06)

中圖分類號R914.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

Studies on the Alkaloid Ingredients ofMacleayacordata

and their Antibacterial Activity

WangChaoyuan1,TongShenglan1,HuXin2,*

(1 College of Life Sciences, South-CentralUniversity for Nationalities, Wuhan 430074, China;

2 College of Pharmacy, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China)

AbstractTo study the composition of alkaloids from Macleaya Cordata(Wild) R.B, those compounds were isolated by silica gel column chromatography and recrystallization. Five alkaloids were isolated and their structures as identified by spectral analysis were protopine (I), pancorine(II), norchelerythrine (III), 6-acetonyldihydrosanguinarine (IV), and 6-acetonyblihydrochelerythrine (V). Among these compound (II) was isolated from this plant for the first time. These alkaloids showed strong antibacterial effect, especially for Staphylocusaureus.

KeywordsMacleayacordata ; alkaloids; antibacterial activity

博落回[Macleayacordata(Wild) R.B]系罌粟科博落回屬植物，是大型直立草本，異名為號簡稈、號簡草、山號簡等，主要分布于貴州、廣東、廣西、福建、江西、湖南、湖北、安徽、江蘇等[1].博落回中已分離得到的化學(xué)成分包括生物堿、萜類化合物、苯丙素類、甾體類化合物等，其有效藥理成分以血根堿(sanguinarine)和白屈菜紅堿(chelerythrine)2種生物堿為代表，此外還含有原阿片堿(protopine)、α-別隱品堿(α-allocryptopine)、β-別隱品堿(β-allocryptopine) 和小檗堿(berberine)、黃連堿(coptisine)、沙明堿(corysamine) 、A 堿、B 堿、C 堿等多種生物堿，其總生物堿多為異喹啉類化合物，含量可達(dá)總質(zhì)量的1.7%.博落回中的生物堿具有驅(qū)蟲、抗菌、消腫、止咳、平喘、陣痛、抗腫瘤等功效，臨床用于痔瘡、疔痛、膿性指頭炎、滴蟲性陰道炎、宮頸糜爛等多種疾病治療，效果明顯[2,3].

為進(jìn)一步研究博落回化學(xué)成分的抗菌活性，尋找新的抗菌活性先導(dǎo)化合物，本文利用硅膠柱層析、重結(jié)晶法對其進(jìn)行分離和純化，從博落回總生物堿中分離得到5種化合物，其結(jié)構(gòu)分別鑒定為原阿片堿(I)，pancorine(II)，去甲基白屈菜紅堿(III)，6-丙酮基二氫血根堿(IV)，6-丙酮基二氫白屈菜紅堿(V)，其中化合物(II)為首次從該植物中分離得到.

1材料與方法

1.1儀器與材料

核磁共振儀(Varian INOVA-300/600Hz型, TMS內(nèi)標(biāo))，質(zhì)譜儀(Bruker esquire 3000 00142型)，循環(huán)真空泵(SHZ-III型, 上海亞榮生化儀器廠)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(SHZ-III型, 上海亞榮生化儀器廠)，紫外分析儀(ZF-6, 上海嘉鵬科技有限公司)，硅膠H、柱色譜硅膠(200～300目)，其余試劑均為分析純(上海試一化學(xué)試劑有限公司).

實(shí)驗(yàn)材料采自于湖北羅田縣，經(jīng)中南民族大學(xué)藥學(xué)院劉新橋博士鑒定為博落回屬.金黃色葡萄球菌(Staphylocusaureus)、枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)、草分枝桿菌(Mycobacteriumphlei)、環(huán)狀芽胞桿菌(Bacilluscirculans)由中南民族大學(xué)生科院微生物教研室提供.

1.2提取分離

博落回地上部分6.3 kg和根部1.77 kg粉碎后用95%乙醇室溫浸泡3次，每次24 h.真空抽濾得濾液，減壓旋蒸，得乙醇提取物.將乙醇提取物用3%的鹽酸溶解，再用氯仿萃取3次，下層收集在一起，脫溶即非生物堿部分.將上層收集在一起，溶液用1%NaOH調(diào)pH至10～11，氯仿萃取，下層收集在一起，即為脂溶性生物堿成分，得地上部分生物堿42 g，根部生物堿24 g.將博落回地上部分脂溶性生物堿進(jìn)行硅膠柱層析，用甲苯-丙酮梯度洗脫(1︰0, 98︰2, 95︰5, 9︰1, 8︰2, 7︰3, 1︰1, 3︰7, 0︰1)，TLC檢測合并，得到原阿片堿(I)，6-丙酮基二氫血根堿(IV)[4].將博落回根部脂溶性生物堿進(jìn)行硅膠柱層析，用甲苯-丙酮梯度洗脫(1︰0, 98︰2, 95︰5, 9︰1, 8︰2, 7︰3, 1︰1, 3︰7, 0︰1)，TLC檢測合并，得到pancorine(II)，去甲基白屈菜紅堿(III)，6-丙酮基二氫白屈菜紅堿(V).

2結(jié)果與分析

2.1抗菌活性分析

將博落回各提取物蒸干并稱重，配成10 mg/mL的提取液，取10 μL提取液點(diǎn)樣于圓濾紙片上使其均勻分布.將各菌液取200 μL接種到含20 mL的固體培養(yǎng)基中充分搖勻后倒平板，待倒好的平板凝固后，將吸附樣品的濾紙片按順序貼于各培養(yǎng)基上，培養(yǎng)過夜，檢測其抑菌圈大小[5].

博落回各提取物和對照樣品的抗菌效果見表1.由表1可見，博落回各部分生物堿提取物對4種代表性細(xì)菌均有顯著的抑制效果，其中地上部分水溶性生物堿對金黃色葡萄球菌和草分支桿菌的抑制作用尤為顯著，其抑菌圈直徑大于18 mm(p<0.001)，10 mg/mL地上部分水溶性生物堿對枯草芽胞桿菌和環(huán)狀芽胞桿菌的抑菌圈直徑為14～16 mm (p<0.01).其次是博落回根部脂溶性生物堿，其抑菌圈直徑為13～16 mm (p<0.05).根部水溶性生物堿對各種菌抑制作用相差不大，其抑菌圈直徑為11～13 mm (p<0.05).而博落回地上部分脂溶性生物堿抑菌效果較弱，其抑菌圈直徑為8～11 mm.4種生物堿提取物對金黃色葡萄球菌抑制作用最好，其抑菌圈直徑均大于其他3種細(xì)菌.

表1　博落回總生物堿抗菌活性

▲含濾紙片直徑6mm ;與對照組相比,*p<0.05 ,**p<0.01,***p<0.001

為開發(fā)利用博落回生物堿這一寶貴天然產(chǎn)物，有必要提取和純化其有效成分，分析和修飾其化學(xué)結(jié)構(gòu)，降低毒性，增強(qiáng)療效.故對博落回脂溶性生物堿進(jìn)一步分離純化，而水溶性生物堿有待下一步研究.

2.2結(jié)構(gòu)鑒定

化合物I：無色針晶，分子式為C20H19O5N.1H NMR (CDCl3, 300 MHz)δ: 6.96(1H, s,H-1), 6.81(1H, s, H-4), 2.81 (2H, brs,H-5), 2.43(2H, brs, H-6), 3.52(2H, brs, H-8), 6.74 (1H,d,J=8.1 Hz, H-11), 6.70 (1H,d,J=8.1 Hz, H-12), 3.80 (2H, brs, H-13), 6.00 (2H, s, -OCH2O-2,3), 5.96 (2H, s, -OCH2O-9,10), 1.84(3H, s, N-CH3).以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]報(bào)道一致，鑒定該化合物為原阿片堿.

化合物II：淡黃色針狀結(jié)晶，分子式為C20H13O5N.1H NMR (CDCl3,300MHz)δ:7.16(1H,s,H-1),7.56(1H,s,H-4), 7.24 (1H,d,J=9.0Hz,H-9),7.75(1H,d,J=9.0Hz,H-10),7.97(1H,d,J=9.0Hz,H-11),7.52(1H,d,J=9.0Hz,H-12) ,6.10 (2H,s,-OCH2O-2,3),6.27 (2H,s, -OCH2O-7,8),3.91(3H,s,-OCH3).以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報(bào)道一致，鑒定該化合物為pancorine.

圖1　化合物Ⅰ-Ⅴ的化學(xué)結(jié)構(gòu)式 Fig.1　The chemical structures of compound Ⅰ-Ⅴ

化合物III：淡白色固體，分子式為C20H15O4N.1H NMR (CDCl3,300 MHz)δ:7.42 (1H, s, H-1),8.68 (1H,s, H-4), 9.69 (1H,s, H-6),7.83 (1H,d,J= 8.7 Hz, H-9), 8.58 (1H, d,J= 8.7 Hz, H-10), 8.52 (1H, d,J=8.1 Hz, H-11),7.97 (1H, d,J= 8.1 Hz, H-12), 6.21 (2H, s, -OCH2O-2,3),4.09 (3H, s, -OCH3), 4.13(3H,s, -OCH3).以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道一致，鑒定該化合物為去甲基白屈菜紅堿.

化合物IV：黃色針晶，分子式為C23H19O5N.1H NMR (CD3COCD3,300 MHZ)δ:7.22 (1H,s, H-1),7.56(1H,s,H-4),4.90 (1H,dd,J= 10.5, 3.9 Hz, H-6), 6.90 (1H,d,J=8.1 Hz,H-9),7.44 (1H,d,J=8.1 Hz,H-10),7.78 (1H,d,J=8.7 Hz,H-11), 7.56 (1H,d,J=8.7 Hz,H-12),6.11(2H,s, -OCH2O-2,3),6.12(2H,s, -OCH2O-7,8),2.86 (1H,dd,J= 15.6, 10.5 Hz,Ha-(CH2-6) ), 2.41(1H,dd,J= 15.6, 3.9 Hz,Hb-(CH2-6)),2.63 (3H,s,N-CH3),2.07 (3H,s, -COCH3);13C NMR(CD3COCD3,75MHz)δ:108.5 (C-1),148.8 (C-2),148.9 (C-3),102.4 (C-4),127.0 (C-4a), 55.5 (C-6),120.3 (C-6a),148.3 (C-7),148.3(C-8),108.6 (C-9),116.8 (C-10),126.1 (C-10a),110.0 (C-10b),120.1 (C-11),120.3 (C-12), 131.0 (C-12a),104.3 (-OCH2O-2,3),105.0(-OCH2O-7,8), 42.8 (N-CH3), 49.8 (-CH2COCH3), 206.0 (-CH2COCH3), 30.1 (-CH2COCH3).以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道一致，鑒定該化合物為6-丙酮基二氫血根堿.

化合物V：黃色針晶，分子式為C24H23O5N.1H NMR (CDCl3,300 MHz)δ:7.10 (1H, s, H-1),7.51(1H, s, H-4), 5.04 (1H, dd,J=11.7, 3.6Hz,H-6),6.95 (1H, d,J= 8.7Hz, H-9), 7.55 (1H, d,J= 8.7Hz, H-10),7.71 (1H, d,J= 8.1 Hz, H-11), 7.48 (1H, d,J= 8.1 Hz, H-12),6.04(2H, s, -OCH2O-2,3), 3.96 (3H,s, -OCH3), 3.92 (3H,s, -OCH3), 2.64 (3H, s, N-CH3), 2.58 (1H, dd,J= 15.3, 11.7 Hz, Ha-(CH2-6)), 2.29 (1H, dd,J= 15.3, 3.6 Hz, Hb-(CH2-6)),2.01(3H, s, -COCH3);13C NMR (CDCl3, 75MHz)δ:104.6 (C-1), 148.4 (C-2),147.8 (C-3),100.8 (C-4),128.4 (C-4a), 139.5 (C-4b), 55.1 (C-6), 127.6 (C-6a),145.8 (C-7),152.4 (C-8), 111.8 (C-9), 119.0 (C-10), 125.0 (C-10a),124.1 (C-10b),120.0 (C-11),123.5 (C-12),131.3 (C-12a), 101.3 (-OCH2O-2,3), 43.1 (N-CH3), 61.2 (-OCH3), 56.1(-OCH3), 47.1 (-CH2COCH3), 207.9 (-CH2COCH3) ,31.4(-CH2COCH3).以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道一致，鑒定該化合物為6-丙酮基二氫白屈菜紅堿.

3結(jié)語

本文通過對博落回化學(xué)成分的系統(tǒng)分離，獲得了5個(gè)生物堿化合物，其中化合物II為首次從該植物中分離得到，拓寬了對博落回生物堿成分的認(rèn)識(shí).對博落回各部分生物堿抗菌活性的研究表明：其對金黃色葡球菌、枯草芽胞桿菌、草分支桿菌和環(huán)狀芽孢桿菌等代表性細(xì)菌具有較強(qiáng)的抑制作用，對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng)，這與博落回生物堿成分具有明顯抗菌消炎等臨床應(yīng)用相一致.博落回的其他臨床癥狀的治療作用如止咳、平喘、止痛、抗腫瘤等尚有待進(jìn)一步研究.

參考文獻(xiàn)

[1]林啟壽. 中草藥成分化學(xué)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1977: 721-725.

[2]茂望, 朱建華. 博落回藥理研究與應(yīng)用概況[J]. 基層中藥雜志, 2002, 16(3):46-48.

[3]郭小清, 康莉平, 聶建超, 等.博落回的藥理作用及其在動(dòng)物保健中的應(yīng)用[J]. 中國動(dòng)物保健, 2005(5): 34-35.

[4]楊光忠，陳玉，李援朝.紅絲線化學(xué)成分研究(Ⅱ)[J].中南民族大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2006，24(2)：23-24.

[5]鐘芳芳，李蕓芳，陳玉，等.虎杖中大黃素的分離及抗菌活性的初步研究[J].中南民族大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2006，25(1)：40-42.

[6]Kubala M, Vacek J, Popa I, et al. The fluorescence properties and NMR analysis of protopine and allocryptopine[J]. J Lumin , 2011, 131(7): 1340-1345.

[7] Chang Y C, Chang F R , Khalil A T ,et al. Cytotoxic benzophenanthridine and benzylisoquinoline alkaloids from Argemone mexicana[J]. Z Naturforsch C, 2003, 58(7/8):521-526.

[8] Tou?ek J , Dostál J, Marek R, et al. Theoretical and experimental NMR chemical shifts of norsanguinarine Andnorchelerythrine[J]. J Mol Struct, 2004, 689(1/2): 115-120.

[9] Julián A, Delgado G. (±) Bocconarborines A and B, novel 1,3-bis-benzo[c]phenanthridinyl acetone alkaloids from Bocconia arborea[J]. Rev Soc Quím Méx, 2001,45(4): 189-194.

[10] Miao F, Yang X J, Zhou L, et al. Structural modification of sanguinarine and chelerythrine and their antibacterial activity[J]. Nat Prod Res, 2011, 25(9): 863-875.