禽流感常見不同亞型間血凝抑制試驗研究

閆海濱，薛樹山，王宏燕，石 霖，李曉楠，何 欣，高 原（1.遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 沈陽 110164；2.遼寧省動物醫(yī)學(xué)研究院，遼寧 沈陽 110164）

禽流感常見不同亞型間血凝抑制試驗研究

閆海濱1，2，薛樹山1，2，王宏燕1，2，石 霖1，2，李曉楠1，2，何 欣1，2，高 原1，2
（1.遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 沈陽 110164；2.遼寧省動物醫(yī)學(xué)研究院，遼寧 沈陽 110164）

本研究通過對禽流感不同亞型間交叉血凝抑制試驗（HI），分析其常見不同亞型及同一亞型不同毒株間HI交叉反應(yīng)情況。試驗結(jié)果表明，禽流感H5、H7和H9亞型中HI交叉保護(hù)極低，甚至可以忽略不計，而同一亞型不同毒株間HI交叉反應(yīng)也表現(xiàn)出較大差異。H5Re-4抗原與H5Re-6、H5Re-7血清HI交叉反應(yīng)為40%；H5Re-6抗原與Re-4 HI交叉反應(yīng)約為77.8%，與H5Re-7血清HI交叉反應(yīng)僅為11%；H5Re-7抗原與H5Re-4血清HI交叉反應(yīng)約為77.8%，與Re-6血清HI交叉反應(yīng)約為55.6%。H7N9抗原與與H7 HI交叉反應(yīng)約為88.9%，而H7抗原與H7N9 HI交叉反應(yīng)約為71%。上述數(shù)據(jù)表明，禽流感免疫時不同亞型的禽流感疫苗并不能互相代替，即使同一亞型不同株疫苗（如H5Re-6與Re-7株疫苗）由于免疫特異性關(guān)系也需要采取針對性疫苗免疫措施。

禽流感；亞型；HI試驗

禽流感（Avian influenza，AI）是由A型流感病毒引起的一種禽類急性高度接觸性傳染病，又稱真性雞瘟或歐洲雞瘟[1]。被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）定為A類傳染病。依據(jù)其外膜血凝素（H）和神經(jīng)氨酸酶（N）蛋白抗原性的不同，分為16個H亞型（H1～H16）和9個N亞型（N1～N9）[2]。H亞型臨床常見主要有H5、H7及H9亞型，各亞型間免疫具有特異性[3]。目前研究表明，由于抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)變的原因即使H5同一亞型不同毒株間也存在著免疫特異性，給其防控工作帶來了很大難度[4]。本研究主要通過HI試驗，分析其不同亞型及同一亞型不同毒株間抗體交叉反應(yīng)情況，為臨床科學(xué)用苗提供科學(xué)依據(jù)。

1 試驗材料

1.1抗原

1.1.1 H5N1抗原 Re-4抗原，批號:2012002；Re-6抗原，批號:2013004；Re-7抗原，批號:2014009。

1.1.2 H7抗原 H7抗原，批號:2014001；H7N9抗原，批號:2013003。

1.1.3 H9抗原 H9抗原，批號:2013002。

1.2陽性血清

1.2.1 H5N1標(biāo)準(zhǔn)陽性血清 H5N1 Re-4標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，批號:2012001；Re-6標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，批號: 2014001；Re-7標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，批號:2014003。

1.2.2 H7標(biāo)準(zhǔn)陽性血清 H7標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，批號: 2013002；H7N9標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，批號:2013001。

1.2.3 H9標(biāo)準(zhǔn)陽性血清 H9標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，批號: 2013001。

以上材料皆購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司。

2 試驗方法

2.1 抗原的標(biāo)定抗原標(biāo)定方法按GB/T18936-2003中微量血凝（HA）試驗技術(shù)執(zhí)行。結(jié)果判定，將反應(yīng)板傾斜，觀察紅細(xì)胞有無呈淚滴狀流淌，完全血凝（不流淌）的抗原或病毒最高稀釋倍數(shù)代表一個血凝單位（HAU）。根據(jù)標(biāo)定結(jié)果配制4個單位的抗原（HAU）。

2.2 交叉血凝抑制試驗分別用4 HAU的H5、H7及H9抗原分別對各標(biāo)準(zhǔn)陽性血清（各設(shè)2組）進(jìn)行HI試驗。結(jié)果判定，以完全抑制4個HAU抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI滴度。

3 試驗結(jié)果

3.1 抗原標(biāo)定結(jié)果6種抗原標(biāo)定結(jié)果詳見表1。

表1 6種抗原標(biāo)定結(jié)果Table1 The calibration results of six kinds of antigens

表2 H5Re-4等6種抗原與6種標(biāo)準(zhǔn)陽性血清HI試驗結(jié)果Table2 The HI test results of H5Re-4.etc antigen and six kinds of standard positive serum

3.2 交叉血凝抑制試驗結(jié)果H5、H7及H9抗原與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清HI試驗結(jié)果詳見表2。

3.2.1 H5抗原與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清HI試驗結(jié)果 H5Re-4抗原與H7、H7N9及H9標(biāo)準(zhǔn)陽性血清沒有抗體交叉反應(yīng)，與H5Re-6、Re-7血清抗體交叉反應(yīng)也僅有40%。 H5Re-6抗原與H7、H7N9及H9標(biāo)準(zhǔn)陽性血清沒有抗體交叉反應(yīng)，與Re-4抗體交叉反應(yīng)約為77.8%，但仍低2倍；與H5Re-7血清抗體交叉反應(yīng)僅為11%。H5Re-7抗原與H7、H7N9及H9標(biāo)準(zhǔn)陽性血清沒有抗體交叉反應(yīng)，與H5Re-4血清抗體交叉反應(yīng)約為77.8%，與Re-6血清抗體交叉反應(yīng)約為55.6%。

3.2.2 H7N9抗原與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清HI試驗結(jié)果 H7N9抗原與H5Re-4、Re-6、Re-7及H9標(biāo)準(zhǔn)陽性血清沒有交叉反應(yīng)，與H7抗體交叉反應(yīng)約為88.9%。H7抗原與H5Re-4、Re-6、Re-7及H9標(biāo)準(zhǔn)陽性血清沒有交叉反應(yīng)，與H7N9抗體交叉反應(yīng)約為71%。

3.2.3 H9抗原與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清HI試驗結(jié)果 H9抗原與H5Re-4、Re-6、Re-7及H7標(biāo)準(zhǔn)陽性血清交叉反應(yīng)HI值全部＜4，與H7N9無抗體交叉反應(yīng)。

4 討論

4.1禽流感不同亞型間免疫交叉保護(hù)力較低，即使同一亞型（如H5亞型）不同毒株由于抗原漂移等原因也存在著免疫特異性[5]。本試驗研究結(jié)果表明，禽流感H5、H7和H9不同亞型間抗體交叉反應(yīng)極低，甚至可以忽略不計，而同一亞型不同毒株間抗體交叉反應(yīng)也表現(xiàn)出較大差異。

4.2本試驗中H5亞型禽流感交叉血凝抑制反應(yīng)表明，經(jīng)典的H5Re-4株與現(xiàn)今使用的Re-6、Re-7株抗體交叉反應(yīng)僅為40%，這也從血清學(xué)上說明原有的H5Re-4株疫苗對H5Re-6、Re-7株不能完全起到抗體交叉保護(hù)作用。而H5Re-6株對Re-7株抗體交叉反應(yīng)幾乎沒有，但H5Re-7株對Re-6株有部分抗體交叉反應(yīng)。H5Re-6株、Re-7株對Re-4株有相對較高的抗體交叉反應(yīng)。

4.32013年上海、安徽等地出現(xiàn)新型重配H7N9禽流感病毒人病例[6]后，我國開始使用H7N9抗原對家禽進(jìn)行血清學(xué)監(jiān)測，與傳統(tǒng)H7抗原相比，二者檢測結(jié)果并不完全一致。本試驗中H7與H7N9抗體交叉反應(yīng)試驗也證明這一點。傳統(tǒng)的H7抗原對H7N9陽性血清抗體交叉反應(yīng)約為71%，而H7N9抗原對H7血清抗體交叉反應(yīng)達(dá)88.9%。

4.4A型禽流感病毒亞型眾多，亞型間免疫交叉保護(hù)情況說法不一，但從禽流感常見不同亞型間交叉HI試驗研究結(jié)果看，H5、H7及H9亞型間抗體交叉反應(yīng)很低，即使同一個亞型不同毒株間抗體交叉反應(yīng)也存在很大差異。因此，就目前來說，禽流感免疫時不同亞型的禽流感疫苗并不能互相代替，即使同一亞型不同株疫苗（如H5Re-6與Re-7株疫苗）由于免疫特異性關(guān)系也需要采取針對性疫苗免疫措施。

[1]Morens DM,Taubenberger JL.Historical thoughts oninfluenzaviralecosystems,orbeholda pale horse, dead dogs, failing fowl, and sick swine[J]. Influenza Other Respi Viruses,2010,4:327-337.

[2]Fouchier RA,Munster V,Wallensten A,et al. Characterization of a novel influenza A virus hemagglutinin subtype (H16) obtained from black-headed gulls[J].J.Virol,79:2814–2822.

[3]李靜，白玉梅.禽流感流行與防制現(xiàn)狀[J].山西師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2004，03：98-102.

[4]熊正慧.我國某地H5亞型禽流感分子流行病學(xué)調(diào)查及變異分析[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[5]曾顯營，鐘功勛，李雁冰，等.禽流感病毒H5N1變異株滅活疫苗(Re-4株)對雞、鴨和鵝的免疫效果研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2010，10：800-803.

[6]石霖，吳運譜，閆海濱，等.動物H7N9禽流感熒光RTPCR檢測技術(shù)[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2013，05：22-24.

Study on the cross-hemagglutination inhibition test of different Avian Influenza subtypes

Yan Haibin1，2,Xue Shushan1，2,Wang Hongyan1，2,Shi Lin1，2, Li Xiaonan1，2,He Xin1，2,Gao Yuan1，2
（1.Liaoning Center for Animal Disease Control and Prevention,Liaoning Shenyang 110164; 2.Animal medicine research institute of Liaoning province,Liaoning Shenyang 110164)

The aim of this study is to evaluate the HI cross-reactivity of H5、H7 and H9 avian influenza subtypes and different strains of the same subtypes.The results showed that the H5,H7 and H9 had a very low HI cross reaction between different subtypes,and the HI reaction between different strains of the same subtype showed great differences.The HI cross response of H5Re-4 antigen and H5Re-6,H5Re-7 positive serum was 40%;H5Re-6 antigen and H5Re-4 positive serum was 77.8%,and H5Re-7 positive serum was 11%;H5Re-7 antigen and H5Re-4 and H5Re-6 positive serum were 77.8%and 55.6%.The HI cross reaction of H7N9 antigen and H7 positive serum were 88.9%,on the contrary H7 and H7N9 were 71%.The data suggested that avian influenza vaccine can not be replaced,even if vaccine with the same subtype but different strains(such as H5Re-6 and Re-7 vaccine)also need a targeted vaccine immune measures.

Avian influenza;Subtype;HI test

S852.65

B

1672-9692(2015)12-0035-03

2015-10-21

閆海濱（1973-），女，本科，獸醫(yī)師，主要從事禽病的檢測與研究。