非諾貝特對過氧化物酶體增殖物激活受體α和單核細胞趨化蛋白-1的影響

非諾貝特對過氧化物酶體增殖物激活受體α和單核細胞趨化蛋白-1的影響

陳福生蒲曉群1

(株州愷德心血管病醫(yī)院心內科，湖南株洲412007)

摘要〔〕目的觀察非諾貝特對氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)增殖、單核細胞過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARα) 和單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)的影響。方法體外培養(yǎng)HUVEC株，第3～5代用于實驗。實驗分3組：①空白對照組；②ox-LDL組(100 mg/L)；③非諾貝特組：先將非諾貝特10、50、100 μmol/L分別作用于內皮細胞24 h，然后加ox-LDL(100 mg/L)作用于細胞24 h。采用細胞酶聯(lián)免疫吸附法分析檢測細胞培養(yǎng)上清液PPARα、MCP-1含量；采用四唑鹽比色法檢測各孔的吸收度(OD)，以評價增殖效果。結果與空白對照組比較，100 mg/L ox-LDL促進內皮細胞增殖(P

關鍵詞〔〕氧化型低密度脂蛋白；臍靜脈；單核細胞過氧化物酶體增殖物激活受體α；單核細胞趨化蛋白-1；非諾貝特；動脈粥樣硬化

中圖分類號〔〕R39〔文獻標識碼〕A〔

1中南大學湘雅醫(yī)院心內科

第一作者：陳福生(1973-)，男，碩士，主要從事冠心病介入治療、藥物治療研究。

動脈粥樣硬化(AS)是缺血性心腦血管疾病的基礎。AS不僅僅是脂質的沉積，更是一種慢性炎癥性疾病〔1〕。單核細胞在AS病變損傷區(qū)黏附、聚集并且進入血管內膜下組織，進而吞噬氧化低密度脂蛋白等，轉化成為泡沫細胞，這是AS形成早期的關鍵步驟之一。對于單核細胞的黏附和聚集，血管細胞黏附分子(VCAM)-1、細胞間黏附分子(ICAM)-1、E-選擇素(E-selectin)、單核細胞趨化蛋白(MCP)-1、白細胞介素(IL)-8等都起了非常重要的作用，其中MCP-1對單核細胞的趨化起著尤為關鍵的作用〔2，3〕單核細胞過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)α活化能抑制炎癥反應而對AS產(chǎn)生影響。本實驗以人臍靜脈內皮細胞為研究對象，觀察貝特類藥物非諾貝特通過激活PPARα，對氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)增殖及MCP-1分泌的影響，為預防AS提供實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料HUVECs購自澳賽爾斯生物技術(上海)有限公司。ox-LDL購自中國協(xié)和醫(yī)科大學基礎研究所。DMEM、胰蛋白酶均購自美國Amresco公司；PPARα、MCP-1試劑盒購自美國R&D公司，M199干粉培養(yǎng)基，美國Gibco公司生產(chǎn)。胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司。羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，上海碧云天生物技術有限公司。非諾貝特及MTT購于美國Sigma公司；培養(yǎng)板購自加拿大Biofil公司。

1.2方法

1.2.1HUVECs的培養(yǎng)和處理取HUVECs解凍，待復蘇后，加入含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基制成細胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶中，置于5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長期的3～5代HUVECs進行消化，制成細胞懸液，調整細胞密度為5×104/ml接種于6孔培養(yǎng)板，每孔分別2 ml，置于CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h。然后更換乏血清培養(yǎng)基(M199+2%胎牛血清+1%HEPES)繼續(xù)培養(yǎng)6 h，使細胞同步化于G0/G1實驗。隨機分為3組：①空白對照組；②ox-LDL組(100 mg/L)；③非諾貝特組：非諾貝特10、50、100 μmol/L。每組設3個復孔，其中非諾貝特組先用上述藥物預處理細胞24 h后，再給ox-LDL(100 mg/L)作用于細胞24 h。然后用0.125%胰蛋白酶進行消化，制備細胞懸液用于實驗。實驗重復3次。

1.2.2細胞培養(yǎng)上清液PPARα、MCP-1含量測定試劑盒購自美國R&D公司，采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測定，嚴格按照說明書操作。過程簡述如下：酶標板中，各孔均加入50 μl孵育液，標準孔內加入不同濃度的標準PPARα、MCP-1溶液50 μl，待測孔內加入稀釋后的細胞培養(yǎng)上清液50 μl，再加入Biotin標記的抗PPARα、MCP-1 50 μl，室溫孵育2 h后，洗板4次，加入HRP標記的工作液100 μl，室溫孵育30 min，洗板后加入顯色液100 μl，再次室溫避光孵育25 min，加入終止液100 μl終止反應，以酶標儀450 nm讀取吸光度值。以標準液的吸光度值對應標準液濃度作圖，并擬和吸光度值相對應于MCP-1、PPARα的濃度的計算公式，計算待測樣本中PPARα、MCP-1的含量，根據(jù)稀釋倍數(shù)計算細胞培養(yǎng)上清液中PPARα、MCP-1的濃度。

1.2.3MTT法評價細胞增殖MTT法將HUVECs以每孔1×104/ml接種于96孔板，每孔200 μl，各實驗組ox-LDL刺激內皮細胞24 h后，每孔加入MTT(濃度為5 mg/ml)繼續(xù)孵育4 h，棄上清液，加入DMSO 顯色酶標儀檢測各孔吸光度A630和A570，A630-A570即為測定值。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件行t檢驗及單因素方差分析。

2結果

2.1HUVECs形態(tài)學觀察倒置顯微鏡下觀察可見，正常的內皮細胞起初呈圓形或橢圓形，多呈小團存在，4 h后開始貼壁，細胞貼壁生長良好，早期細胞呈小多角形、球形、團狀，逐漸生長成梭形，胞體呈多角形，相互嵌合，呈鋪路石狀鑲嵌排列，細胞透明度大。

2.2各組及不同濃度非諾貝特對HUVECs增殖及PPARα、MCP-1分泌的影響各組及不同濃度非諾貝特對HUVECs增殖及PPARα、MCP-1分泌的影響，見表1。

組別HUVECs增殖PPARα(pg/ml)MCP-1(pg/ml)空白對照組0.425±0.026128.68±56.76150.13±69.29ox-LDL組0.767±0.0481)78.56±38.421)889.26±92.391)非諾貝特10μmol/L0.656±0.0381)286.96±52.761)629.41±51.971)非諾貝特50μmol/L0.576±0.0322)516.86±65.462)432.56±46.192)非諾貝特100μmol/L0.465±0.0262)767.69±89.762)292.66±34.652)

與空白對照組比較:1)P<0.01；與ox-LDL組比較:2)P<0.01

3討論

AS是重要的心血管疾病之一，其發(fā)病機制仍未完全闡明。近年研究認為，AS發(fā)生的始動環(huán)節(jié)是血管內皮細胞(VEC)的損傷，低密度脂蛋白(LDL)通過損傷的血管內皮細胞間隙彌散進入血管內皮下，被自由基和活性氧等修飾氧化為ox-LDL〔4〕。ox-LDL可誘導多種炎性因子的表達，如細胞間黏附因子-1、VCAM-1、MCP-1等，其中，MCP-1在AS的發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用。MCP-1能與單核細胞表面的 CC類趨化因子受體2(CCR2)受體特異結合，使單核細胞經(jīng)損傷內皮細胞間隙遷移入內皮下，演變?yōu)榫奘杉毎?，巨噬細胞通過清道夫受體不斷吞噬ox-LDL，啟動了炎癥反應過程，巨噬細胞吞噬脂質構成泡沫細胞，平滑肌細胞增殖、移動，最終形成脂紋和粥樣斑塊〔5，6〕抗MCP-1基因轉染不僅顯著抑制AS斑塊的起始和發(fā)生，而且還能限制AS斑塊的進展，使不穩(wěn)定的AS斑塊轉化為更穩(wěn)定的AS斑塊。Porreca等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)，MCP-l不僅是趨化激活因子，對泡沫細胞形成極為重要，又能促進人臍靜脈血管平滑肌(HUVSMC)增殖。本研究也發(fā)現(xiàn)ox-LDL誘導HUVEC高表達MCP-1，也能促進HUVEC增殖，從而促進AS的發(fā)生和發(fā)展〔8〕。研究報道在培養(yǎng)的內皮細胞和LDL注射胎牛血清，非諾貝特可抑制ox-LDL和LDL誘導的氧化應激，抑制內皮細胞增殖。本實驗發(fā)現(xiàn)，非諾貝特對ox-LDL誘導的人HUVEC MCP-1分泌有抑制作用，抑制內皮細胞增殖，阻止AS發(fā)展〔9〕。

非諾貝特是一種人工合成的PPARα的激活物，是廣泛用于治療高甘油三酯的降脂藥物。PPARα激動劑可調節(jié)脂質代謝，也可通過不依賴降脂作用在不同階段阻礙AS的進程。早期可改善動脈血管的順應性；其次可減少炎癥因子水平〔10〕。激活的PPARα可以降低炎癥因子的基因表達、減輕細胞間的黏附和遷移，改善內皮細胞的功能〔11〕。PPARα的活化可改變血液中LDL與高密度脂蛋白(HDL)的比值，升高HDL、降低LDL，增加膽固醇的清除，從而減少泡沫細胞的形成，減緩AS〔12〕。PPARα的激活劑非諾貝特可以通過抑制活化蛋白-1、核轉錄因子-κB的活化，下調活性氧等途徑，減少MCP-1的表達，從而減少血管壁單核細胞的聚集，降低炎癥反應，保護內皮細胞。本實驗結果說明非諾貝特通過激活PPARα，從而抑制HUVEC增殖及MCP-1分泌。

本實驗說明，非諾貝特呈劑量依賴性促進ox-LDL誘導的人HUVEC分泌PPARα，抑制人HUVEC分泌MCP-1，抑制內皮細胞增殖，揭示非諾貝特具有抗炎效應，是保護內皮功能的又一途徑。因此，臨床上應用抗AS一方面發(fā)揮其高效的降脂作用，還可以行使其保護內皮及AS的功能。

4參考文獻

1崔耀剛.老年冠心病患者血清CRP、IL-6、sICAM-1水平變化及意義〔J〕.中國老年學雜志,2013；33(5)：1184-5.

2高瑜.急性冠狀動脈綜合征老年患者血清中GDF-15、MCP-1和IL-23的表達及意義〔J〕.中國老年學雜志,2013；33(9)：2144-5.

3王績英,王濤.過氧化物酶體增殖因子激活受體α研究新進展〔J〕.中國老年學雜志，2011；31(12):2387-9.

4張如卉,李志樑,付強,等.組織因子對人臍靜脈內皮細胞單核細胞趨化蛋白-1表達的影響〔J〕.中國老年學雜志,2012；32(10):2109-11.

5王玲香,郭擁軍.分泌型磷脂酶A2對臍靜脈內皮細胞分泌和表達MCP-1、ICAM-1的影響〔J〕.中國老年學雜志，2011；31(3):465-7.

6張巧麗,閆輝,唐朝樞,等.硫化氫抑制氧化型低密度脂蛋白誘導的人巨噬細胞單核細胞趨化蛋白-1分泌的作用〔J〕.實用兒科臨床雜志,2012；27(7):513-4.

7Porreca E，Di Febbo C，Reale M，etal.Monocyte chemotactic protein-1(MCP-1) is a mitogen for culured rat vascular smooth muscle cells〔J〕.J Vasc Res,1997；34(1):58-65.

8Yang TL，Chen MF，Luo BL，etal.Fenofihrate decreases asymmetric dimethylarginine level in cultured endothelial cells by inhibiting NF-kappaB activity〔J〕.Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol,2005；371(5):401-7.

9王績英,王濤,曾錦榮，等.三氧化二砷增強PPAR-α受體激動劑非諾貝特對肺癌A549細胞遷移和侵襲運動能力的影響〔J〕.中國老年學雜志,2012；32(10):2091-4.

10祝河忠,屈巧芳,胡新貴,等.苯扎貝特對靜脈內皮細胞基質金屬蛋白酶-9表達的影響及機制〔J〕.中國心血管病研究,2009；6(12):924-7.

11Pyper SR，Viswakarma N，Yu S,etal.PPAR alpha：energy combustion hypolipidemia，inflammation and cancer〔J〕.Nucl Recept Signal，2010；8(4) :e002.

12Dragomir E，Tircol M，Manduteanu I，etal.Aspirin and PPAR-alpha activators inhibit monocyte chemoattactant protein-1 expression induced by high glucose concentration in human endothelial cells〔J〕.Vasc Pharmacol，2006；44(6) :440-9.

〔2013-11-18修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)