HPLC－DLS法表征麻杏石甘湯中甘草酸成分

沈 勇，楚秋平，高觀禎，柯李晶，2，周建武，2，饒平凡，2

(1．福州大學(xué)生物工程研究所，福建福州 350002;2．中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院－浙江工商大學(xué)食品營(yíng)養(yǎng)科學(xué)聯(lián)合研究中心，浙江杭州 310035)

0 引言

麻杏石甘湯源自漢代張仲景的《傷寒論》，是中國(guó)傳統(tǒng)經(jīng)典中藥方劑之一，由麻黃、苦杏仁、石膏、甘草四味藥組成，具有辛涼宣泄、清肺平喘的功效．甘草益氣和中，與石膏合而生津，并能調(diào)和于寒溫宣降之間，于麻杏石甘湯中為佐使之用．甘草酸作為甘草的主要活性成分之一，多以鉀鹽、鈣鹽的形式存在，其鹽較易溶于水，具有抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)、抗病毒，清熱解毒，抗氧化［1－2］調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力，保肝［3］等廣泛的生物活性［4］．以往對(duì)甘草藥材或湯劑中甘草酸檢測(cè)都有研究報(bào)道，但麻杏石甘湯煎煮過(guò)程中甘草酸的質(zhì)量濃度變化及其在湯劑中的具體存在形式尚未見有系統(tǒng)研究．

動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)(dynamic light scattering，DLS)是指通過(guò)測(cè)量散射光強(qiáng)的起伏變化來(lái)得出樣品顆粒大小信息的一種技術(shù)，可用于分析溶液中顆粒粒徑大小、分布和聚集狀態(tài)等多種信息．通過(guò)高效液相色譜和動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)的聯(lián)用對(duì)麻杏石甘湯煎煮過(guò)程中的甘草酸成分進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果不僅反映了中藥湯劑煎煮過(guò)程甘草酸質(zhì)量濃度的變化規(guī)律，還體現(xiàn)了煎煮過(guò)程中甘草酸分子聚集成為膠體顆粒的過(guò)程．

1 材料

1．1 材料與試劑

生麻黃、杏仁、炙甘草、石膏(購(gòu)于北京市雙橋燕京中藥飲片廠)經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)張小如教授鑒定;甘草酸單銨對(duì)照品(購(gòu)于福建省福州市藥品檢驗(yàn)所，批號(hào)110731－200615);甲醇(色譜純);醋酸銨、冰醋酸(分析純);純凈水．

1．2 儀器

Amicon Ultra 30 ku超濾離心管(美國(guó) Millipore公司);L－2130高效液相色譜儀(日本 HITACHI公司);Daisogel－C18反相色譜柱(北京創(chuàng)新通恒科技有限公司);Nano ZS90 Zetasizer激光粒度分析儀(英國(guó)Malvern公司);CF15RX高速離心機(jī)(日本HITACHI公司)．

2 方法

2．1 麻杏石甘湯樣品制備

稱取藥材麻黃9 g，苦杏仁9 g，甘草6 g和石膏24 g，加200 mL水單煎麻黃20 min，然后加入預(yù)先浸泡于500 mL水中30 min的余藥共煎60 min，經(jīng)紗布過(guò)濾后，加一級(jí)水至400 mL得麻杏石甘湯樣品．

2．2 高效液相色譜分析條件

參考中國(guó)藥典［5］和其他常用甘草酸檢測(cè)方法［6］，色譜分析柱為 Daisogel－ C18(250 mm×4．6 mm，5μm)，流動(dòng)相甲醇 －0．2 mol·L－1醋酸銨溶液 －冰醋酸體積比為67 ∶33 ∶1，流速 1．0 mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm，柱溫25℃，進(jìn)樣量20μL．

2．3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

將甘草酸單銨置于105℃ 干燥箱中烘干3 h后，精密稱量甘草酸單銨對(duì)照品7．5 mg，甲醇溶解定容至10 mL，搖勻得0．75 mg·mL－1對(duì)照品溶液．將其稀釋成500、250、125、62．5、31．25、15．6、7．8 μg·mL－1對(duì)照液．0．45μm微孔濾膜過(guò)濾，依次進(jìn)樣20μL，得到甘草酸濃度(mg·mL－1)與峰面積 (A)的標(biāo)準(zhǔn)曲線．

2．4 精密度試驗(yàn)和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，每次20μL，進(jìn)行色譜分析，考察此方法的精密度．取制備的麻杏石甘湯樣品液重復(fù)測(cè)定6次，考察其重復(fù)性．

2．5 煎煮過(guò)程甘草酸質(zhì)量濃度的變化

煎煮過(guò)程湯劑的制備方法同2．1，加入三味藥材(苦杏仁，甘草，石膏)開始計(jì)時(shí)(該時(shí)刻取樣標(biāo)注為0 min)，每隔10 min取樣．樣品處理:經(jīng)5 000 r·min－1離心30 min，0．45μm 膜過(guò)濾，進(jìn)樣20μL，HPLC測(cè)定其甘草酸質(zhì)量濃度變化．

2．6 湯劑中甘草酸的聚集狀態(tài)

取2．5中樣品，樣品①:經(jīng)5 000 r·min－1離心30 min，為超濾前樣品，待用;樣品②:經(jīng)5 000 r·min－1離心30 min，過(guò)30 ku超濾膜超濾，為超濾后樣品，待用．兩組樣品經(jīng)0．45μm膜過(guò)濾，HPLC測(cè)定其甘草酸質(zhì)量濃度，應(yīng)用動(dòng)態(tài)光散射(DLS)原理，聯(lián)用Nano ZS90 Zetasizer粒度儀，分別測(cè)定其平均粒徑變化．

3 結(jié)果分析

3．1 甘草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

甘草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程 Y=35 869 224．65X+3 616．03(R2=0．999 3)，表明甘草酸進(jìn)樣量在0．156～15μg與峰面積(A)的線性范圍良好．

3．2 麻杏石甘湯中甘草酸質(zhì)量濃度

甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜保留時(shí)間為7．95 min，據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可知，麻杏石甘湯樣品中甘草酸質(zhì)量濃度為86．0 μg·mL－1，即每克炙甘草含 5．73 mg 甘草酸．

3．3 精密度實(shí)驗(yàn)和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

甘草酸的峰面積RSD為2．25%(n=6)，表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果精密度良好;麻杏石甘湯中RSD為2．14%(n=6)，表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性良好．

表1 甘草酸精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果和麻杏石甘湯原湯重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab．1 Precision of glycyrrhizic acid and repeated of Ma－Xing－Shi－Gan decoction

3．4 煎煮過(guò)程中甘草酸質(zhì)量濃度的變化

測(cè)定不同煎煮時(shí)間，麻杏石甘湯中甘草酸質(zhì)量濃度變化，結(jié)果如圖1所示，0～20 min甘草酸質(zhì)量濃度從0上升到80．1μg·mL－1;20～60 min甘草酸質(zhì)量濃度基本不變，約82．4μg·mL－1．0～20 min 為麻杏石甘湯中甘草酸的溶出期，其濃度與煎煮時(shí)間成正相關(guān)．20 min后，麻杏石甘湯中甘草酸濃度基本達(dá)到飽和．

圖1 麻杏石甘湯煎煮過(guò)程中甘草酸質(zhì)量濃度變化Fig．1 The glycyrrhizic acid contents during the water boiling processing of Ma－Xing－Shi－Gan decoction

3．5 煎煮過(guò)程及超濾前后麻湯中甘草酸的聚集狀態(tài)

圖2所示，麻湯經(jīng)超濾處理，甘草酸基本被30 ku超濾膜截留，在超濾液中質(zhì)量濃度不超過(guò)4．01μg·mL－1．甘草酸單體(相對(duì)分子質(zhì)量為822．9 u)相對(duì)分子質(zhì)量遠(yuǎn)小于30 ku，理論上可完全透過(guò)30 ku超濾膜，徐浩坤等［7］研究表明甘草酸可透過(guò)30 ku超濾膜，透過(guò)率達(dá)90%以上．湯劑中甘草酸透過(guò)率僅為5．2%，推測(cè)甘草酸在水溶劑和麻杏石甘湯中的存在形式不同．

圖2 煎煮過(guò)程中，超濾前后麻湯中甘草酸質(zhì)量濃度的變化Fig．2 The glycyrrhizic acid contents during the water boiling processing of Ma－Xing－Shi－Gan decoction pre－/aft－ ultrafiltration

圖3 煎煮過(guò)程中，超濾前后湯劑中顆粒平均粒徑的變化Fig．3 Average particle size variation of the Ma－Xing－Shi－Gan decoction pre－/aft－ ultrafiltration

如圖3所示，麻黃單煎20 min和其他三味藥(苦杏仁、甘草和石膏)混合形成粒徑約為200．0 nm的納米顆粒，隨著煎煮時(shí)間延長(zhǎng)，粒徑逐漸增加到270．1 nm;超濾后樣品由于截留作用，檢測(cè)不到明顯的顆粒．

研究表明，甘草酸具有和生物大分子發(fā)生超分子作用形成顆粒的能力［8］，陳求浩等［9］研究表明麻黃堿和甘草酸能分別與生石膏中的 Ca2+、Fe2+、Zn2+和 Mn2+形成ML和 ML2型不同穩(wěn)定程度的絡(luò)合物．圖3中湯劑里顆粒平均粒徑逐漸增大，可能是由于溶出的甘草酸等與其他藥效成分相互作用形成更大的納米顆粒．

對(duì)比麻杏石甘湯超濾前后樣品中甘草酸質(zhì)量濃度變化(圖2)和超濾前后顆粒平均粒徑變化(圖3)，表明麻杏石甘湯煎煮過(guò)程中，甘草酸從藥材釋放到湯劑中，不是以單體形式存在的，而是通過(guò)超分子作用自聚或與其它化學(xué)成分形成相對(duì)分子質(zhì)量大于30 ku的納米顆粒，其粒徑約為250．0 nm．

4 結(jié)論

通過(guò)HPLC檢測(cè)煎煮過(guò)程中麻杏石甘湯中甘草酸質(zhì)量濃度的變化，發(fā)現(xiàn)麻杏石甘湯中甘草酸的煎出率與煎煮時(shí)間相關(guān)，質(zhì)量濃度為82．4μg·mL－1;對(duì)比超濾前后甘草酸質(zhì)量濃度變化，推測(cè)甘草酸以自聚或復(fù)合膠束形式存在于湯劑中．聯(lián)用Nano ZS90 Zetasizer粒度儀，從顆粒角度進(jìn)一步探討麻杏石甘湯中甘草酸以聚集狀態(tài)存在，研究表明，甘草酸在湯劑中會(huì)自聚或與其他大分子物質(zhì)結(jié)合形成平均粒徑為250．0 nm的復(fù)合膠束．而它在湯劑中自聚方式、或與其他大分子物質(zhì)的具體結(jié)合方式和數(shù)量比目前還有待進(jìn)一步探究．

藥物單體組分在體內(nèi)與其它成分之間能發(fā)生非化學(xué)本質(zhì)的相互作用，并可能進(jìn)而改變藥效．以麻黃的主要藥效成分麻黃堿為例，它在有咖啡因存在的情況下其藥物代謝和對(duì)激素分泌的刺激能力等指標(biāo)均發(fā)生顯著變化［10］．膠體是藥物成分之間通過(guò)各種次級(jí)鍵介導(dǎo)的超分子作用而形成的，在多種中藥單復(fù)方煎劑中都廣泛存在，并與煎劑的藥效作用有直接聯(lián)系［11］．對(duì)麻杏石甘湯中甘草酸質(zhì)量濃度及存在形式的研究表明，對(duì)于解釋方藥藥效和多種成分之間的復(fù)雜聯(lián)系，不僅要關(guān)注其質(zhì)量濃度，其存在形式更為我們提供了新的闡述視角．