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    一種與核黃素合酶α亞基具有結(jié)構(gòu)相似性的板藍(lán)根多肽的分離純化與表征

    2015-12-29 05:09:00楚秋平高觀禎周建武
    關(guān)鍵詞:核黃素合酶板藍(lán)根

    林 煒,楚秋平,王 茜,高觀禎,周建武,2

    (1.福州大學(xué)生物工程研究所,福建福州 350002;2.中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院-浙江工商大學(xué)食品營養(yǎng)科學(xué)聯(lián)合研究中心,浙江杭州 310035)

    0 引言

    板藍(lán)根別名靛青根、藍(lán)靛根、靛根,為十字花科植物菘藍(lán)(Isatis indigotica Fort.)的干燥根,是我國最常用的傳統(tǒng)中藥材,是清熱解毒類中藥的代表,廣泛用于治療多種疾病,如感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、流行性腮腺炎、扁桃體炎、丹毒、各種肝炎、乙型腦炎等[1-6].近年來,板藍(lán)根在現(xiàn)代臨床上廣泛應(yīng)用于病毒性流感的預(yù)防與治療.

    核黃素合酶作為核黃素合成最后一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶,在很多細(xì)菌和酵母中都要依賴該酶形成內(nèi)源核黃素,而動物和人類都缺少該酶,無法自身合成,只能從食物中獲取,因此在人類和動物疾病檢測和疫苗設(shè)計上,核黃素合酶作為一個很重要的靶標(biāo)已經(jīng)發(fā)揮了巨大的作用[7].目前對核黃素合酶的研究主要集中在細(xì)菌和酵母等生物[8-9],對植物中核黃素合酶的研究還很少,僅在少數(shù)幾種植物上克隆了編碼核黃素的基因,如菠菜、小麥、大麥、高粱、水稻等[10-13],但這些基因的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及其功能還有待研究.

    本研究對板藍(lán)根水提物中的多肽組分進(jìn)行了分離純化,得到了一條相對分子質(zhì)量約為7 ku的多肽組分,并對其基本生化性質(zhì)和細(xì)胞毒性、抗病毒活性進(jìn)行研究.通過數(shù)據(jù)比對,發(fā)現(xiàn)該多肽在結(jié)構(gòu)上和核黃素合酶α亞基具有一定的同源性.

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    板藍(lán)根鮮根(安徽阜陽太和縣阮橋鎮(zhèn)板藍(lán)根GAP生產(chǎn)基地);中空纖維膜(截流相對分子質(zhì)量為6 000 u);離子交換色譜SP-5PW(3.9 mm×300 mm,日本TOSOH公司);疏水色譜POROSHP2(4.6 mm×250 mm,美國POROS公司);低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品(Amersham公司);高速冷凍離心機(jī)(Beckman公司);冷凍干燥機(jī)(ALPHA 1-2LD);DYY-5型恒壓恒流電泳儀(北京市六一儀器廠);所用試劑均為分析純.

    1.2 方法

    1.2.1 板藍(lán)根鮮根蛋白粗提液的制備

    稱取板藍(lán)根鮮根500 g,切片后凍于-80℃冰箱,直至硬脆后取出置于高速粉碎機(jī)充分粉碎,于1500 mL 0.01 mol·L-1、pH 7.2 的磷酸鹽緩沖液(Na2HPO4-NaH2PO4,含0.1 mol·L-1NaCl)中充分浸潤,于4 ℃下攪拌浸提24 h,17 500 r·min-1、4℃下離心20 min,收集上清液,所得上清液即為板藍(lán)根鮮根蛋白粗提液.

    1.2.2 中空纖維膜超濾

    板藍(lán)根鮮根粗提液經(jīng)過中空纖維膜超濾濃縮后,用0.02 mol·L-1、pH 4.0檸檬酸緩沖液透析,透析結(jié)束后,于17 500 r·min-1、4℃下離心20 min,所得上清液即為板藍(lán)根鮮根蛋白粗提濃縮液.

    1.2.3 陽離子交換色譜

    用0.02 mol·L-1、pH 4.0檸檬酸緩沖液預(yù)先平衡SP-5PW強(qiáng)陽離子交換色譜柱,流動上樣30 mL,0 ~0.15 mol·L-1NaCl、0.15 ~1 mol·L-1NaCl階段梯度洗脫,流速1.0 mL·min-1,檢測波長280 nm.

    1.2.4 疏水色譜

    用 0.02 mol·L-1、pH 6.0 的磷酸鹽緩沖液(含1 mol·L-1(NH4)2SO4)預(yù)先平衡 POROS 20 HP2 疏水色譜柱,上樣5 mL,1 ~0 mol·L-1(NH4)2SO4梯度洗脫,流速2.0 mL·min-1,檢測波長280 nm.

    1.2.5 RIP2 相對分子量測定

    參考王旭等[14]的方法,濃縮膠濃度為4%,中間膠濃度為10%,分離膠濃度16.5%,以上濃度皆為體積質(zhì)量.

    1.2.6 RIP2 等電點測定

    參照趙先亮等[15-16]的方法,采用垂直板等點聚焦的方法測定RIP2的等電點.

    1.2.7 RIP2 N 端序列測定

    多肽RIP2經(jīng)過還原SDS-PAGE和電印跡后由福州大學(xué)生物工程研究所采用基于Edman降解法的測序儀進(jìn)行N端氨基酸序列測定.

    Edman降解法由偶聯(lián)試劑PITC與多肽鏈自由N末端基團(tuán)反應(yīng),生成苯氨基硫甲酰肽(PTC肽).偶聯(lián)反應(yīng)在45~48℃進(jìn)行約15 min并用過量的試劑使有機(jī)反應(yīng)完全.用無水強(qiáng)酸如三氟乙酸(TFA),使第一個殘基環(huán)化,從而使該殘基從剩余的肽鏈裂解出來,并成為2-苯胺基-噻唑啉酮衍生物(ATZ氨基酸)[17].

    1.2.8 RIP2 MDCK 細(xì)胞毒性

    0.25%的胰酶將MDCK細(xì)胞消化后,用MEM培養(yǎng)基制成濃度為4×105cell·mL-1的細(xì)胞懸液.將制備好的MDCK細(xì)胞懸液接種于96孔板中(每孔200μL)置于37℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2和95%濕度的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24 h后,棄培養(yǎng)液.96孔板用PBS清洗2次,于每孔內(nèi)加入濃度分別為9、4.5、2.25、1.13、0.56、0.28 mg·mL-1的樣品200μL,于37 ℃、5%CO2和95%濕度的培養(yǎng)條件下孵育48 h,以每孔加細(xì)胞維持液200μL作為正常細(xì)胞對照組.取出孵育48 h的MDCK細(xì)胞,棄上清液,于每孔加入1 mg·mL-1的3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)50μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,再每孔加入150μL二甲基亞楓(DMSO)作用10 min,于570 nm波長下測量吸光值.

    以下式計算細(xì)胞存活率S:其中:S為細(xì)胞存活率(%);A0為正常細(xì)胞對照組于570 nm測得的吸光度;A為實驗樣品于570 nm測得的吸光度.

    1.2.9 RIP2抗流感病毒活性測定

    在樣品濃度范圍內(nèi)(0.28~9.00 mg·mL-1),對RIP2樣品進(jìn)行連續(xù)2倍梯度稀釋.在已形成單層細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中加入100TCID50病毒稀釋液,每孔200μL,34℃吸附2 h后棄病毒液,用細(xì)胞PBS清洗2遍,加已稀釋好的RIP2各濃度樣品,每孔200μL,每濃度4孔,于34℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h,以每孔加入200μL細(xì)胞維持液作為細(xì)胞陰性對照組.用MTT比色法于570 nm波長下測量吸光值,并計算其抗病毒活率.計算公式如下:

    其中:A對照組為正常細(xì)胞陰性對照;A病毒組為陽性對照組.

    2 結(jié)果與討論

    2.1 活性多肽的分離與純化

    板藍(lán)根鮮根蛋白粗提濃縮液經(jīng)陽離子交換階段梯度洗脫時,如圖1所示,洗脫得到四個吸光值較高的組分峰:SP1、SP2、SP3和SP4,分別收集穿透峰及SP1、SP2、SP3、SP4進(jìn)行SDS-PAGE檢測,如圖2所示,穿透峰無蛋白條帶,SP3和SP4各有一條濃度較高的蛋白條帶,而RIP2在峰SP1中,將其與濃縮液電泳條帶相比較,結(jié)果表明,粗提液經(jīng)陽離子交換色譜分離后,目標(biāo)多肽得到初步的分離.

    圖1 SP-5PW分離圖譜Fig.1 Chromatogram of SP -5PW

    圖2 SP-5PW色譜SDS-PAGE圖Fig.2 SDS-PAGE chromatogram of SP-5PW

    峰SP1經(jīng)過POROS HP2疏水色譜柱的分離共洗脫出兩個峰,分別收集穿透峰、峰SP1HPP1和峰SP1HPP2,如圖3所示.經(jīng)SDS-PAGE鑒定,RIP2在峰SP1HPP2中,如圖4所示.對峰SP1HPP2進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE鑒定,結(jié)果顯示RIP2已經(jīng)達(dá)到了電泳純,如圖5所示.

    2.2 板藍(lán)根蛋白的性質(zhì)表征

    2.2.1 RIP2 相對分子質(zhì)量標(biāo)定

    RIP2經(jīng)過Tricine-SDS-PAGE后,分別量出Tricine-SDS-PAGE電泳膠上標(biāo)準(zhǔn)蛋白、待測蛋白和染料距分離膠頂端的距離,計算出相對遷移率(即樣品遷移距離/染料遷移距離),以標(biāo)準(zhǔn)蛋白的分子質(zhì)量的對數(shù)對它的相對遷移率作圖,得到蛋白相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線.由該標(biāo)準(zhǔn)曲線可以計算出RIP2的相對分子質(zhì)量為6.87 ku.

    圖3 POROSHP2分離圖譜Fig.3 Chromatogram of POROSHP2

    圖4 POROSHP2色譜SDS-PAGE圖Fig.4 SDS - PAGE chromatogram of POROSHP2

    圖5 RIP2-SDS-PAGE圖Fig.5 SDS - PAGEof RIP2

    2.2.2 RIP2 等電點測定

    通過計算相對遷移率(即樣品遷移距離/膠條總長),可以計算出RIP2的等電點為7.73.RIP2等電點偏堿性,說明RIP2的堿性氨基酸含量較高,含有較多的自由氨基.

    2.2.3 RIP2 N 端序列測定

    對轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上的RIP2進(jìn)行N端氨基酸序列的測定,測定了10個氨基酸殘基,依次為QIGEFATAPF.通過NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫的檢索,發(fā)現(xiàn)其與核黃素合酶α亞基具有同源性,序列比對結(jié)果如表1.核黃素合酶在植物生長發(fā)育、信號傳導(dǎo)及抗病性上的作用僅在少數(shù)幾種植物中進(jìn)行了部分研究.如擬南芥的核黃素合酶可通過與生物激發(fā)子HpaGxoo作用從而發(fā)揮一定的抗病防衛(wèi)作用[18];而水稻核黃素合酶對植物的生長發(fā)育、活性氧的消除、抗病性以及細(xì)胞死亡都有非常重要的作用[12].有研究表明核黃素分子中較長的D-核糖醇支鏈阻礙了異咯嗪平面環(huán)與DNA的嵌插作用,因而其主要作用方式是溝面作用和靜電作用.通過這些作用核黃素可部分干擾DNA的模板作用,產(chǎn)生一定的抗腫瘤、抗病毒功能[19].因此可推測該多肽對板藍(lán)根自身生長及其抗病毒性具有一定影響.

    表1 RIP2N同源性比對結(jié)果Tab.1 The homology comparision of RIP2N

    2.2.4 RIP2抗流感病毒活性研究

    板藍(lán)根常用于治療風(fēng)熱感冒等病癥[20],狗腎上皮細(xì)胞(Madin-Darby Canine Kidney cells,MDCK)是流感病毒的易感細(xì)胞株之一[21],故MDCK細(xì)胞和流感病毒相互作用模型常用于中藥抗流感病毒研究[22].本實驗利用MDCK細(xì)胞對板藍(lán)根肽組分RIP2抗病毒作用進(jìn)行研究.

    RIP2抗流感病毒活性研究結(jié)果如圖6所示.?dāng)?shù)據(jù)經(jīng)SPSS軟件分析,得F值為73.362,P值為0.000,小于0.01,說明數(shù)據(jù)表現(xiàn)為極顯著.

    如圖6(a)所示,在9.00~0.56 mg·mL-1濃度內(nèi),RIP2對MDCK細(xì)胞表現(xiàn)出較大的毒性作用,其中在9.00 mg·mL-1時,對MDCK細(xì)胞的抑制作用達(dá)到35%;但是隨著RIP2濃度的逐漸降低,其毒性也對應(yīng)降低,直到一定濃度下不再表現(xiàn)出毒性(數(shù)據(jù)沒有顯示).同時,對應(yīng)濃度的RIP2樣品對MDCK細(xì)胞抗流感病毒的治療實驗從圖6(b)可知:RIP2濃度為4.50 mg·mL-1時,RIP2對MDCK細(xì)胞表現(xiàn)出較高的治療效果,其治療率可以達(dá)到35%,隨著濃度的降低治療效果逐步降低,直到0.56 mg·mL-1時,其治療效果已不顯著.其中RIP2濃度為9.00和0.28 mg·mL-1時,其對MDCK細(xì)胞不具有治療效果,根據(jù)圖6(a)可推測其為該濃度下RIP2本身對MDCK細(xì)胞的毒性作用大于治療作用所致.

    圖6 RIP2對MDCK細(xì)胞毒性與治療實驗結(jié)果圖(n=6)Fig.6 The result of RIP2 on MDCK cytotoxicity and therapeutic experiment(n=6)

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