離子色譜 乙酸定量法測(cè)定殼聚糖脫乙酰度

林智威，王艷花，盧珩俊，陳梅蘭*

離子色譜 乙酸定量法測(cè)定殼聚糖脫乙酰度

林智威，王艷花，盧珩俊，陳梅蘭*

（浙江樹人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310015）

建立離子色譜-電導(dǎo)法測(cè)定甲殼素發(fā)酵液中乙酸根含量，以確定甲殼素脫乙?；^程中脫乙酰度。樣品前處理為取發(fā)酵液放入無菌離心管中，以10 000 r/min離心15 min，取上清液過0.45 μm醋酸纖維濾膜后進(jìn)樣分析，將檢測(cè)的乙酸值換算成脫乙酰度。結(jié)果表明，該方法達(dá)到很好的分離效果，在0.5～25.0 mg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回收率為95.04%～102.25%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于2.99%，與目前常用的酸堿滴定法和電位滴定法相比，具有簡(jiǎn)單、快捷、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確等特點(diǎn)，適用于生產(chǎn)企業(yè)對(duì)甲殼素脫乙?；^程的實(shí)時(shí)監(jiān)控及甲殼素脫乙酶的優(yōu)化，可為工業(yè)化殼聚糖脫乙酰度的監(jiān)測(cè)以及評(píng)價(jià)降解酶活性提供一定依據(jù)。

殼聚糖；甲殼素；脫乙酰度；乙酸；離子色譜法

甲殼素又稱幾丁質(zhì)，是一種由N-乙酰-D-葡萄糖胺單體通過β-1,4-糖苷鍵連接而成的直鏈高分子化合物（圖1），其廣泛存在于蝦、蟹等甲殼動(dòng)物，以及部分植物、細(xì)菌和真菌等生物中，年平均產(chǎn)量接近100億 t，是僅次于纖維素的第二大類天然高分子化合物。殼聚糖為甲殼素經(jīng)脫乙酰化的產(chǎn)物，是由β-（1,4）-2-氨基-2-脫氧-β-D-葡萄糖單元和β-（1,4）-2-乙酰胺基-2-脫氧-β-D-葡萄糖單元組成的共聚物（圖2），也是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一天然堿性多糖，具有良好生物相溶性，在生物醫(yī)學(xué)及制藥等方面的應(yīng)用極其廣泛，例如在控制膽固醇、抑制細(xì)菌活性、預(yù)防和控制高血壓、吸附和排泄重金屬、提高免疫效果等方面具有較好的療效[1-2]。

圖 1 甲殼素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structural formula of chitin

目前，國(guó)內(nèi)外甲殼素脫乙酰的方法有化學(xué)降解法、物理降解法和脫乙酰酶降解法。其中脫乙酰酶降解法因其特異性和高的選擇性、降解過程溫和、耗能低等特點(diǎn)而優(yōu)于其他兩種降解方法[3-5]，具有較大的發(fā)展空間。然而目前通過篩選得到的甲殼素脫乙酰酶活性較低，應(yīng)用于工業(yè)化還需要進(jìn)一步篩選和優(yōu)化，生產(chǎn)企業(yè)還是以堿法降解為主。在脫乙酰酶的優(yōu)化過程中，甲殼素脫乙酰度是脫乙酰酶活性選擇的依據(jù)，也是殼聚糖產(chǎn)品質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。直至目前，國(guó)內(nèi)外沒有統(tǒng)一的脫乙酰度的檢測(cè)方法。國(guó)內(nèi)企業(yè)主要采用酸堿滴定法[6]或膠體滴定法[7]。這兩種方法操作簡(jiǎn)單、技術(shù)要求低，但是酸堿滴定終點(diǎn)判斷誤差較大，重復(fù)性不好[8]，而膠體滴定法雖然比較穩(wěn)定，重復(fù)性較好，但是誤差也很大，有時(shí)測(cè)定的脫乙酰超過100%。許多學(xué)者對(duì)脫乙酰度的檢測(cè)方法進(jìn)行了研究，如電位滴定法[9]、酶前處理電位滴定法[10]、氫溴酸鹽法[11]、光折射率傳感法[12]、熱分析法[13]、元素分析法[14]、一階導(dǎo)數(shù)紫外光譜法[15]、紅外光譜[16-18]、核磁共振法[19-21]、X射線衍射法[22]和圓二色譜法[23]等。在這些方法中，電位滴定法的誤差較大，氫溴酸鹽法和苦味酸分光光度法實(shí)驗(yàn)耗時(shí)太長(zhǎng)，一階導(dǎo)數(shù)紫外光譜法由于乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖的最大吸收峰有重疊引起干擾，影響檢測(cè)結(jié)果。元素分析基于碳氮比的不同，甲殼素中殘余氮對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響很大。核磁共振法準(zhǔn)確度雖高，但儀器價(jià)格昂貴使用成本高，不易推廣。因此，建立一種操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高的甲殼素脫乙酰度的檢測(cè)方法非常必要。本實(shí)驗(yàn)基于甲殼素不論堿法降解或是酶法降解后脫除的乙?；詈缶兂梢宜猁}或乙酸的事實(shí)，通過測(cè)定乙酸根的含量，進(jìn)而推算甲殼素的脫乙酰度，考慮到該方法簡(jiǎn)單準(zhǔn)確，可監(jiān)控甲殼素實(shí)際生產(chǎn)的脫乙酰度。

圖 2 殼聚糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.2 Chemical structural formula of chitosan

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

甲殼素 浙江金殼生物化學(xué)有限公司；配制淋洗液用碳酸鈉、碳酸氫鈉為優(yōu)級(jí)純；發(fā)酵液 浙江樹人大學(xué)活潑教師實(shí)驗(yàn)室；發(fā)酵使用的培養(yǎng)基由常量營(yíng)養(yǎng)鹽和兩種微量元素溶液組成，其中常量營(yíng)養(yǎng)鹽含磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈉、氯化鈣、氯化銨、蛋白胨等；微量元素溶液1由鹽酸、氯化鎂、氯化鈷、氯化鋅、硼酸、氯化銅、氯化鎳和 鉬酸鈉組成，微量元素溶液2由乙二胺四乙酸二鈉（disodium ethylenediaminetetraacetate dihydrate，EDTA-2Na）及氯化亞鐵組成；培養(yǎng)基使用的試劑（均為分析純） 杭州華東醫(yī)藥股份有限公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水由Milli-Q純水儀純化（電阻率18.2 MΩ·cm）。

IC-2010離子色譜儀（帶自動(dòng)進(jìn)樣器、抑制方法是膠抑制、檢測(cè)方法是電導(dǎo)檢測(cè)） 日本Tosoh公司；高壓蒸汽滅菌鍋、SKY-2102C型溫振蕩培養(yǎng)箱、SW-CJ-2FD型凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵

根據(jù)前期培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，在超凈臺(tái)上將徹底滅菌的足量培養(yǎng)基分別分裝至已滅菌的三角瓶中，用接種環(huán)接入足量已培養(yǎng)好的菌株，再向其中加入適量甲殼素，16 層紗布封口，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)。

1.2.2 樣品前處理

取發(fā)酵液2 mL放入無菌離心管中，10 000 r/min離心15 min，去除樣品中的菌體，取上清液過0.45 μm醋酸纖維濾膜，再取0.5 mL定容至25 mL容量瓶，搖勻后放入樣品瓶進(jìn)樣分析。將檢測(cè)的乙酸換算成脫乙酰度。

1.2.3 色譜條件

離子交換柱：保護(hù)柱TOSOH TSKguardcolumn SuperIC-AZ（4.6 mm×1 cm），分析柱TOSOH TSKgel SuperIC-AZ （4.6 mm×15 cm，4 μm）；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：30 μL；淋洗液：1.9 mmol/L NaHCO3＋3.2 mmol/L Na2CO3；流速：0.5 mL/min；膠抑制電導(dǎo)檢測(cè)。

1.3 脫乙酰度的計(jì)算[24]

式中：Q為樣品質(zhì)量/g；n為發(fā)酵過程中脫去乙酰基的糖殘基的物質(zhì)的量，以檢測(cè)出發(fā)酵液中乙酸的物質(zhì)的量代替；N為樣品總的糖殘基的物質(zhì)的量；161為脫乙酰度為100%時(shí)殼聚糖殘基的平均相對(duì)分子質(zhì)量；203為脫乙酰度為0時(shí)殼聚糖殘基的平均相對(duì)分子質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 淋洗液的選擇

通過多次實(shí)驗(yàn)，淋洗液為1.9 mmol/L NaHCO3＋3.2 mmol/L Na2CO3，流速：0.5 mL/min時(shí)，發(fā)酵液中陰離子能完全分離，具體見圖3。

在1.2.3節(jié)的色譜條件下，乙酸的線性范圍由標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、25.0 mg/L制得。重復(fù)性由0.5 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進(jìn)樣6 次求得，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.18%。檢出限（RSN=3）為0.48μg/L，如表1所示。

圖 3 發(fā)酵液中7 種陰離子標(biāo)準(zhǔn)色譜圖Fig.3 Standard chromatogram of seven anions in the fermented fluid

表 1 線性范圍、重復(fù)性及檢出限Table 1 Linear range, reproducibility and limits of detection

為了進(jìn)一步考察基體對(duì)結(jié)果的影響，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)一個(gè)發(fā)酵48 h的甲殼素發(fā)酵液樣品進(jìn)行分析，測(cè)得乙酸質(zhì)量濃度為5.13 mg/L，并按樣品測(cè)定值的20%、50%和80%即1.0、2.5、4.0 mg/L進(jìn)行加標(biāo)測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表2，回收率為95. 04%～102.25%。發(fā)酵液樣品按照1∶10稀釋的譜圖見圖4。

Table 2 Recoveries of spiked samples (n=3）表 2 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n = 3)

圖 4 樣品稀釋色譜圖Fig.4 Chromatogram of 10-fold diluted sample

2.2 EDTA的影響

考慮到發(fā)酵液中使用了EDTA，而EDTA由4 個(gè)乙酸基組成，在發(fā)酵過程中可能生成乙酸會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響，因此在其他培養(yǎng)條件相同的條件下，不添加甲殼素進(jìn)行發(fā)酵，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行處理后進(jìn)樣檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在乙酸保留時(shí)間位置不出峰。可見，乙酸對(duì)方法不產(chǎn)生影響。

2.3 乳酸的影響

考慮到甲殼素在酶的作用下可能生成乳酸或生成的乙酸在酶的作用下轉(zhuǎn)換成乳酸，進(jìn)而對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響，因?yàn)槿樗岷鸵宜醿煞逵幸恍┲丿B。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了100 個(gè)發(fā)酵液樣品，發(fā)現(xiàn)有2 個(gè)樣品檢測(cè)到很小的乳酸峰。因此可認(rèn)為甲殼素發(fā)酵基本不會(huì)生成乳酸，也不會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響。

2.4 脫乙酰度的計(jì)算

脫乙酰度為甲殼素轉(zhuǎn)換成殼聚糖的轉(zhuǎn)換率，或是 其脫乙?；省Ｄ壳八釅A滴定法計(jì)算公式見式（2）或（3）[25]：

式（2）、（3）中：C1和C2分別為鹽酸和氫氧化鈉的濃度；V1為加入鹽酸的體積；V2為滴定耗用的氫氧化鈉的體積；m為被測(cè)溶液殼聚糖產(chǎn)品的質(zhì)量；M為殼聚糖的平均相對(duì)分子質(zhì)量（161）。

由公式（2）和（3）可知，只有純品（100%）甲殼素脫去乙酰基，用上式公式得到的殼聚糖含量可以看作是脫乙 酰度的百分率，嚴(yán)格來講是殼聚糖的質(zhì)量百分率。當(dāng)不純的甲殼素即在總鏈節(jié)上既有殼聚糖分子鏈，也有甲殼素分子鏈時(shí)上述公式計(jì)算都會(huì)出現(xiàn)誤差，而在公式（1）中，發(fā)酵液中生成乙酸的量是真實(shí)甲殼素脫乙?；螽a(chǎn)生的，因此測(cè)定發(fā)酵液中乙酸的含量計(jì)算脫乙酰度是正確的。生產(chǎn)企業(yè)在用甲殼素作為原料生產(chǎn)殼聚糖時(shí)，可直接測(cè)定發(fā)酵液中的乙酸按公式（1）計(jì)算脫乙酰度作為控制生產(chǎn)工藝質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，脫乙酰度越大，甲殼素轉(zhuǎn)換為殼聚糖的得率越高。廠方對(duì)最終殼聚糖質(zhì)量指標(biāo)的確定一般按公式（2）、（3）進(jìn)行計(jì)算。因此在實(shí)際生產(chǎn)中，脫乙酰度指標(biāo)，可用作生產(chǎn)過程中工藝內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)，殼聚糖含量可作為殼聚糖質(zhì)量指標(biāo)。

為了進(jìn)一步衡量該方法的可行性，與傳統(tǒng)滴定法的比較。取按1.2.1節(jié)方法發(fā)酵后發(fā)酵液進(jìn)行乙酸含量的檢測(cè)，最按公式（1）計(jì)算得到的脫乙酰度為44.62%，以得到的殼寡糖產(chǎn)品，用滴定法按公式（2）計(jì)算，得出的脫乙酰度為48.01%，兩者有一定的差異，這可能是甲殼素本身含有殼聚糖分子鏈有關(guān)。

3 結(jié) 論

通過離子色譜測(cè)定經(jīng)脫乙酰酶作用后甲殼素中乙酸根含量的測(cè)定，以便評(píng)估甲殼素的脫乙酰度以及脫乙酰酶的活性。該方法達(dá)到了很好的分離效果，回收率為95.04%～102.25%，在0.5～25.0 mg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性效果，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于2.99%，該方法簡(jiǎn)單準(zhǔn)確，即使樣品的發(fā)酵液中含Mo，整個(gè)分析時(shí)間只需要30 min即可完成，可以用于甲殼素工業(yè)化中脫乙酰度的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。

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Determination of Degree of Deacetylation of Chitosan by Ion Chromatographic Quantitation of Acetic Acid

LIN Zhiwei, WANG Yanhua, LU Hengjun, CHEN Meilan*
(College of Biological and Environmental Engineering, Zhejiang Shuren University, Hangzhou 310015, China)

Chitosan is the product of chitin deacetylation. Therefore, the degree of deacetylation can be obtained by determining the content of acetic acid. In this paper, a method was developed to assess the degree of deacetylation of chitosan by quantitating acetic acid concentration using ion chromatography. The fermented liquid was centrifuged in sterile centrifuge tubes at 10 000 r/min for 15 min to remove the bacterial cells. Then the supernatant fluid was filtered through a 0.45 μm cellulose acetate membrane and injected into ion chromatography system. Good chromatographic separation was achieved. This method had good linearity in the range of 0.5–25.0 mg/L and its recoveries ranged from 95.04% to 102.25%, with relative standard deviation (RSD) lower than 2.99%. It is simple, quick and more accurate as compared with the traditional titration method and can be used to monitor deacetylation of chitin and optimize deacetylase activity.

chitosan； chitin； degree of deacetylation； acetic acid； ion chromatography

TS201.2

A

1002-6630（2015）08-0171-04

10.7506/spkx1002-6630-201508031

2014-04-21

浙江省自然科學(xué)重點(diǎn)基金項(xiàng)目（Z14B070002）；國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng)（CB10-06）

林智威（1995—），男，本科生，研究方向?yàn)槭称贩蛛x與分析。E-mail：mxt644143284@163.com

*通信作者：陳梅蘭（1964—），女，教授，本科，研究方向?yàn)樯V分離分析。E-mail：rain-lake@163.com