槲皮素對(duì)NAFLD大鼠血清SOD活力和MDA含量的影響

李秀麗，白 音，劉志杰，劉青妍，周家樂，李林曄，吳傳昊，趙燕星，鄭曉敏

（赤峰學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver diseases,NAFLD）是一種進(jìn)展性疾病.發(fā)病機(jī)制不清，1998年Day和James提出的“二次打擊”學(xué)說現(xiàn)已成為解釋NAFLD發(fā)生機(jī)制的主要理論.“第一次打擊”主要是指胰島素抵抗（IR）和脂代謝紊亂所導(dǎo)致的肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積，形成單純性脂肪肝，而在此基礎(chǔ)上發(fā)生的氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化損傷成為NAFLD發(fā)病中的“第二次打擊”[1]，這些因素可以使脂肪變性后的肝細(xì)胞更易受到損傷進(jìn)一步出現(xiàn)炎癥，而發(fā)展成為非酒精性脂肪性肝炎.筆者在前期研究中闡述了槲皮素（Quercetin）通過影響IR和調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝對(duì)改善脂質(zhì)堆積細(xì)胞模型的改善作用[2-3]，本文在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究槲皮素是否通過影響氧化應(yīng)激改善NAFLD.

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)雄性SD大鼠50只，體重180g～200g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK2012-0001.動(dòng)物飼養(yǎng)于赤峰學(xué)院醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室動(dòng)物室，4-5只分籠飼養(yǎng)，自由攝食進(jìn)水.溫度23℃-24℃，濕度40%-45%，12小時(shí)明暗交替.

1.2 試劑與藥物

甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-c）、高密度脂蛋白膽固醇（HLD-c）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所.槲皮素購(gòu)自鄭州荔諾生物科技有限公司.

1.3 方法

SD大鼠50只，4-5只分籠飼養(yǎng)，經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為 5組：正常對(duì)照組（Con）、模型組（Model）、槲皮素低劑量組 （QuL，100mg/kg）、槲皮素中劑量組（QuM，200mg/kg）、槲皮素高劑量組（QuH，300mg/kg），每組為 10只.Model、QuL、QuM、QuH組各給予高脂飼料（2g膽固醇、10g豬油、0.3g膽酸鈉、87.7g普通飼料），建立NAFLD模型，Con組給予普通飼料喂養(yǎng).各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皆自由飲水.第8周末從普通飼料組和高脂組各取出一只做病理驗(yàn)證是否成膜.9周開始QuL組、QuM組、QuH組每日上午8:30-9:00定時(shí)灌胃，分別給予槲皮素100mg/kg、200mg/kg、300mg/kg， Con組和mode兩組給予蒸餾水4mg/kg,每日一次.槲皮素治療4周，所有大鼠隔夜禁食12小時(shí)后，麻醉后解剖，自腹主動(dòng)脈取血，離心取血清備用.迅速取出肝組織，用濾紙吸干表面，稱重，并取肝右葉組織外側(cè)端一塊投入10%的多聚甲醛中固定以利于病理檢查.其余肝組織投于液氮中速凍后，置于-80℃冰箱備用.

1.4 觀測(cè)項(xiàng)目與方法

（1）觀察SD大鼠的精神與食欲狀態(tài)、毛發(fā)和活動(dòng)情況.在全部實(shí)驗(yàn)完成后測(cè)體重和肝濕重，計(jì)算肝指數(shù)（肝指數(shù)=肝濕重 /體重×100%）；（2） 血清 ALT、AST、TG、TC,LDL-C、HDL-C指標(biāo)的測(cè)定，采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè).（3）肝組織SOD，MDA含量的測(cè)定.稱取大鼠肝組織200mg，加冰生理鹽水2mL后制成10%勻漿，4℃3500r·min離心15min后取上清液，SOD測(cè)定采用黃嘌呤氧化酶法，MDA采用硫代巴比妥酸比色分析法，操作步驟按試劑盒說明書.

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般結(jié)果

各組大鼠均發(fā)育良好.正常組大鼠精神狀態(tài)、進(jìn)食與生長(zhǎng)正常，活動(dòng)度好，毛色潤(rùn)澤，皮毛整潔，無死亡.造模期間，高脂組進(jìn)食正常，毛色偏黃暗淡，體重增加明顯，模型組體形增長(zhǎng)較給藥組快，各組活動(dòng)度較好，造模期間各組大鼠均未出現(xiàn)腹瀉及死亡（表1）.

2.2 肝臟病理染色

第八周末取高脂飼料組和普通飼料組肝臟病理標(biāo)本，經(jīng)HE染色顯示,形成NAFLD模型.藥物干預(yù)4周結(jié)果，HE染色觀察，Con組肝細(xì)胞排列整齊,肝小葉規(guī)則,細(xì)胞呈多邊形,中央有大而圓的核,細(xì)胞質(zhì)均勻,肝細(xì)胞內(nèi)無脂滴沉積.Model組肝細(xì)胞腫脹,胞質(zhì)中出現(xiàn)大小不均的脂滴空泡,以大泡性脂肪滴為主,核居邊,細(xì)胞界限不清.QueL組脂滴空泡有所減少,QueM、QueH劑量組脂滴空泡顯著下降(圖1).

圖1 肝臟的HE染色

2.3 槲皮素對(duì)大鼠肝臟指數(shù)的影響

與Con組比較，Model組大鼠體重增加明顯（p＜0.05），肝濕重和肝指數(shù)均顯著高于Con組(P＜0.05).與Model組相比，喂養(yǎng)4周末時(shí)QuL、QuM、QuH組大鼠體重均明顯下降(中、高劑量組P＜0.05，低劑量組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），肝濕重明顯降低(中劑量組P＜0.05，高劑量組P＜0.01，低劑量組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，高劑量組大鼠肝指數(shù)明顯降低(P＜0.05)，而低、中劑量組大鼠肝指數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)見表1.

表1 槲皮素對(duì)各組大鼠體重、肝濕重及肝指數(shù)(±s)的影響

表1 槲皮素對(duì)各組大鼠體重、肝濕重及肝指數(shù)(±s)的影響

與 Con 比較，*P＜0.05， **P＜0.01； 與 Model組比較,#P＜0.05，##P＜0.01

組別 n 體重/g 肝臟濕重/g 肝指數(shù)/%Con 9 449.40±42.37 11.75±0.44 2.44±0.06 Model 9 612.88±46.90*19.77±0.43*3.82±0.06 QuH 10 539.64±39.78##13.23±0.65##3.24±0.43#QuM 10 552.23±48.43#16.54±0.98#3.68±0.17#QuL 10 580.34±37.78 15.11±1.21 3.26±0.13

2.4 槲皮素對(duì)血清、肝組織生化指標(biāo)的影響

2.4.1 槲皮素對(duì)血脂的影響：給槲皮素4周后QuH組、QuM組和QuL組大鼠血清TG、TC與Model組比較均有下降（P＜0.05)，其中QuH組TG顯著下降 (為P＜0.01)，QuM、QuH組的LDL-c組有下降趨勢(shì)（P＞0.05)，而對(duì)于HDL-C的測(cè)定QuH、QuM、QuL組與Model組比較有升高趨勢(shì)，但沒有差異（P＞0.05)，詳見表2.通過對(duì)肝組織中TG、TC的測(cè)定，Model組與Con組比較有顯著性差異（P＜0.05).給藥組三個(gè)劑量組與模型組比較都有所降低（P＜0.05)，其中高劑量組降低膽固醇比較明顯，具有非常顯著差異（P＜0.01），詳見表 3.

表2 槲皮素對(duì)各組大鼠血脂的影響（±s)

表2 槲皮素對(duì)各組大鼠血脂的影響（±s)

與 Con 比較，*P＜0.05;與 Model組比較,#P＜0.05，##P＜0.01

組別 n TG/mmol.L-1 TC/mmol.L-1 LDL-c/mmol.L-1 HDL-c/mmol.L-1 Con 9 1.47±0.25 2.86±0.16 0.72±0.27 0.88±1.03 Model 9 3.76±0.14* 7.92±1.98* 5.67±0.09* 0.46±0.09*QuH 10 2.01±0.18## 6.32±2.28# 4.79±0.08 0.44±0.15 QuM 10 2.78±0.21# 5.83±1.30# 4.66±1.25 058±0.12 QuL 10 2.89±0.16# 5.86±1.821# 5.48±1.17 0.67±0.27

表3 槲皮素對(duì)各組大鼠肝組織TG、TC含量和脂質(zhì)氧化指標(biāo)的影響（±s)

表3 槲皮素對(duì)各組大鼠肝組織TG、TC含量和脂質(zhì)氧化指標(biāo)的影響（±s)

與 Con 比較，*P＜0.05;與 Model組比較,#P＜0.05，##P＜0.01

組別 n TG/mg.g-1 TC/mg.g-1 SOD(U.mg-1) MDA(nmmol.ml-1)Con 9 1.50±0.04 2.9±0.24 187.21±24.30 1.54±2.35 Model 9 7.76±0.10* 5.65±0.21* 111.87±4.23* 3.26±5.49*QuH 10 3.36±0.16# 2.78±024## 148.89±5.58# 1.29±1.87##QuM 10 3.99±0.29# 3.46±0.33# 142.34±4.78# 2.31±1.67##QuL 10 4.77±0.07# 3.58±0.20# 128.89±2.89 2.97±1.98

2.4.2 槲皮素對(duì)肝功能的影響：給藥4周后，與Model組比較給藥組大鼠血清ALT降低（QuL組和QuH組P＜0.05，而QuM組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）；QuM組和QuH組大鼠血清AST較Model組降低 (P＜0.05，P＜0.01)，而QuL組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表 4）.

2.4.3 槲皮素對(duì)脂質(zhì)氧化的影響：與Con組比較，Model組SOD活性顯著降低(P＜0.05)，MDA顯著升高(P＜0.05).Model組QuM和QuH組大鼠的SOD明顯提高（P＜0.05），QuL組無意義.QuM、QuH組大鼠MDA與Model組相比均降低了，呈現(xiàn)非常顯著性差異(P＜0.01)，QuL組MDA無顯著性意義（表 3）.

表4 槲皮素對(duì)各組大鼠肝功能的影響(±s)

表4 槲皮素對(duì)各組大鼠肝功能的影響(±s)

與 Con 比較，*P＜0.05;與 Model組比較,#P＜0.05，##P＜0.01

組別 n ALT/U.L-1 AST/U.L-1 Con 9 34.87±3.89 169.98±12.32 Model 9 66.56±6.23** 253.54±17.98*QuH 10 41.90±8.57# 190.23±17.45#QuM 10 67.90±10.97 201.87±14.45#QuL 10 48.26±8.11# 248.21±9.12

3 討論

隨著糖尿病和肥胖在世界范圍的流行，與之密切相關(guān)的NAFLD發(fā)病率也在不斷提高，正日益成為公共健康問題.盡管目前學(xué)者們對(duì)NAFLD的病理生理學(xué)機(jī)制進(jìn)行了大量研究，但其明確的發(fā)病機(jī)制和治療藥物現(xiàn)仍然不明確.國(guó)內(nèi)外的學(xué)者針對(duì)其治療藥物和發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了廣泛的研究.在本研究中，利用高脂飲食誘導(dǎo)形成的非酒精性單純性脂肪肝模型，槲皮素組與模型組比較能改善高脂飲食誘導(dǎo)的SD大鼠模型的脂質(zhì)堆積，降低TG和TC水平，降低ATL、AST.其作用機(jī)制如何？本研究從氧化應(yīng)激和抗氧化的兩個(gè)關(guān)鍵因子入手.

近年來，有關(guān)氧化應(yīng)激發(fā)病機(jī)制和抗氧化劑在NAFLD發(fā)病進(jìn)程中的防治作用日益引起廣泛關(guān)注[4].氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化被認(rèn)為可能是導(dǎo)致NAFLD并促其發(fā)展的最主要因素之一.在病理情況下活性氧（reactive oxygen soecies,ROS）的產(chǎn)生增多，超過抗氧化系統(tǒng)的清除能力出現(xiàn)相對(duì)或絕對(duì)過剩，其攻擊臨近組織、細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激.氧化應(yīng)激和ROS形成的主要部位，也是ROS打擊的首要靶點(diǎn)是肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞線粒體.線粒體是肝細(xì)胞最重要的細(xì)胞器之一，是肝臟脂肪酸進(jìn)行β氧化和三羧酸循環(huán)、ATP、ROS形成的主要場(chǎng)所.盡管線粒體能夠修復(fù)ROS導(dǎo)致的線粒體DNA（mtDNA）的損傷，但由于mtDNA靠近細(xì)胞內(nèi)膜（ROS的產(chǎn)生部位）并缺乏組蛋白和非組蛋白的保護(hù)，修復(fù)程序不完整，易受細(xì)胞內(nèi)氧自由基侵襲，導(dǎo)致mtDNA堿基對(duì)的缺失突變，從而影響肝細(xì)胞脂肪代謝[5-6].

在NAFLD時(shí)，肝臟脂質(zhì)沉積使血清游離脂肪酸增多，肝臟攝取更多的游離脂肪酸增加了線粒體β氧化代償性速度，進(jìn)而使得ROS產(chǎn)生增加，一方面導(dǎo)致mtDNA損傷加劇，另一方面ROS損傷線粒體呼吸鏈，阻斷呼吸鏈的任何部位又可導(dǎo)致ROS的增加，增加的ROS進(jìn)一步增加氧化性脂質(zhì)堆積，引起更多的脂質(zhì)過氧化，抑制呼吸鏈的電子傳遞，形成一個(gè)惡性循環(huán)[7].

在氧化應(yīng)激過程中的丙二醛（MDA）是ROS與細(xì)胞膜磷脂的不飽和脂肪酸反應(yīng)形成的物質(zhì)，是評(píng)價(jià)人體氧化應(yīng)激的一個(gè)非常重要的指標(biāo).機(jī)體存在兩類抗氧化系統(tǒng)，其中一類是酶抗氧化系統(tǒng)，包括SOD、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等.抗氧化物質(zhì)的消耗形成另一個(gè)惡性循環(huán)，脂肪堆積產(chǎn)生的的ROS等物質(zhì)能消耗SOD等抗氧化物質(zhì)，抗氧化物質(zhì)的減少更易導(dǎo)致ROS對(duì)線粒體的損害效應(yīng).因此SOD的檢測(cè)和評(píng)價(jià)也作為人體氧化應(yīng)激和抗氧化最常用的另一指標(biāo).本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)MDA和SOD可知機(jī)體氧化應(yīng)激和抗氧化物質(zhì)的程度.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Model組大鼠血清中SOD活力與Con組大鼠相比明顯降低（P＜0.05），MDA含量升高顯著（P＜0.05），提示 NAFLD的發(fā)生與氧應(yīng)激和抗氧化物質(zhì)的損傷的程度有關(guān).給藥四周后，槲皮素中、高劑量與模型組比較能明顯提高SOD（P＜0.05），降低MDA（P＜0.05），說明槲皮素起到了明顯的抗氧化作用，并且槲皮素高劑量組大鼠肝臟脂肪變化明顯較空白模型組輕，推測(cè)槲皮素治療NAFLD的重要機(jī)制可能是自身作為一種抗氧化劑，具有明顯的抗氧化作用，抑制或防止脂質(zhì)過氧化，減輕肝臟脂肪沉積.至于槲皮素治療NAFLD的其他機(jī)制還有待進(jìn)一步研究.

〔1〕李秀麗,唐曉光,高麗楓，等.蓽茇-13味治療大鼠非酒精性脂肪肝病的實(shí)驗(yàn)研究[J]．赤峰學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2011，27（1）：35-37．

〔2〕李秀麗，鄒繼紅，劉青妍，等．槲皮素改善肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]．時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2011，22(10):2384～2386．

〔3〕XIULI LI, RONG WANG, NA ZHOU,et,al.Quercetin improves insulin resistance and hepatic lipid accumulation in vitro in a NAFLD cell model.BIOMEDICAL REPORTS 1:71-76,2013．

〔4〕董婷，盧勝家，劉璇，等.氧化應(yīng)激在非酒精性脂肪性肝炎發(fā)病機(jī)制中的作用[J].肝臟,2012,17(8):602-604．

〔5〕楊麗麗,柳濤,王森,等.氧化應(yīng)激與非酒精性脂肪性肝病研究進(jìn)展[J].世界華人消化雜志，2009，17(9):896-900．

〔6〕池肇春,周長(zhǎng)宏,史光軍,等.非酒精性脂肪性肝病[M].北京：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，2009．80．

〔7〕Michikawa Y，Mazzucchelli F，Bresolin N,et al.Agingdependent large accumulation of point mutations in the human mtDNA control region for replication[J]．Science，1999，286：774～779．