響應(yīng)面法優(yōu)化竹葉總黃酮的提取工藝

陳 宇，陳基棚，董映雪

（莆田學(xué)院 環(huán)境與生物工程學(xué)院，福建 莆田 351100）

竹子是禾本科(Poaceae)竹亞科(Bambusoideae)多年生常綠植物，研究表明，竹葉中含有大量的黃酮類化合物和其他生物活性成分，如酚酸、活性多糖、香豆素類內(nèi)酯、蒽醌類化合物、特種氨基酸等[1].生物類黃酮化合物具有抗衰老、預(yù)防心血管疾病和清除自由基等生理功能[2].目前，對竹葉黃酮類物質(zhì)的研究已成為一個熱點，鄔建敏等采用高效液相色譜法測定10種竹類的葉、枝中黃酮類化合物的含量，得出竹葉中的黃酮含量要高于竹枝中的黃酮含量[3].宋倩等[4]利用響應(yīng)面法對核桃殼總黃酮的提取工藝進行優(yōu)化，得到核桃殼總黃酮的最佳提取工藝：乙醇濃度59%，提取溫度為78℃，液固比為33∶1，核桃殼總黃酮含量為3.61mg?g-1.晏麗等[5]采用微波輔助提取，正交法優(yōu)化提取工藝，研究石榴葉總黃酮的提取工藝，結(jié)果表明:黃酮的最佳提取工藝為：乙醇濃度80%、提取功率200W、提取時間2min、提取次數(shù)3次.

目前，國內(nèi)對黃酮類化合物的提取有水提法、醇提法，而且以醇提法研究居多，采用響應(yīng)面法優(yōu)化竹葉黃酮的提取工藝的研究鮮有報道，為此，本研究以莆田學(xué)院校園內(nèi)的竹子葉片為材料，采用響應(yīng)面法優(yōu)化黃酮提取工藝，為竹子的綜合開發(fā)利用提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原材料

竹葉（佛肚竹）采自莆田學(xué)院芳名湖畔，經(jīng)烘箱60℃烘干，再用研缽研碎，過60目篩備用.

1.1.2 試劑

蘆丁標準品（99%，鄭州荔諾生物科技有限公司），氫氧化鈉、三氯化鋁、硝酸鋁、亞硝酸鈉、乙醇、石油醚等均為分析純試劑.

1.1.3 主要儀器

BS224S電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；722型分光光度計（上海光譜儀器有限公司制造）；RE52CS-2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；DGH-9246電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）.

1.2 方法

1.2.1 竹葉黃酮的提取工藝

稱取一定量干燥的竹葉顆粒，加入一定量體積和一定量濃度的溶劑，在一定溫度下加熱回流提取一定的時間，過濾，濾渣用少量不同濃度溶劑洗滌合并濾液，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去多余的溶劑，將所得的濃縮液用石油醚萃取多次后，取下層溶液，定容至50mL，充分搖勻備用[6].

1.2.2 黃酮含量的測定

標準曲線的繪制參照陳宇等的方法[6]，得到蘆丁溶液濃度C(mg·mL-1)與吸光度A的回歸方程為：A=10.114 3C-0.0096，相關(guān)系數(shù)R2為0.996.

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計

在陳宇等[6]單因素試驗的基礎(chǔ)之上，選擇乙醇濃度（A）、料液比(B)、水浴溫度(C)和反應(yīng)時間(D)為四個因素對竹葉黃酮類物質(zhì)提取率的影響，取四個因素中較優(yōu)的三個水平來作對比選用，Design-Expert V8.0.6試驗設(shè)計，以竹葉的總黃酮得率為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面分析試驗(Box-Behnken)，試驗的因素水平見表1.

表1 竹葉提取工藝響應(yīng)面試驗因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 二次響應(yīng)面回歸模型的建立與分析

以A、B、C、D為變量，以竹葉總黃酮提取率為響應(yīng)值（Y），進行了響應(yīng)面分析試驗，做試驗方案及結(jié)果見表2.表中1~24號是析因試驗，25~29號是中心試驗.29個試驗點是析因點和零點，其中析因點是自變量取值在A、B、C、D所構(gòu)成的三維頂點，零點為區(qū)域的中心點，零點試驗重復(fù)5次，用以估計實驗誤差[7].

將實驗值Y對方程的預(yù)測值Y0一一對應(yīng)，擬合后得竹葉總黃酮得率的實驗值與預(yù)測值對應(yīng)關(guān)系的線性方程：Y=0.957X+0.034，R2=0.961.方程的斜率為0.957，方程的相關(guān)系數(shù)R2為0.961.這顯示了方程的預(yù)測值與實驗值符合性的比較好.

利用Design-Expert V8.0.6軟件對試驗結(jié)果進行多元回歸擬合分析處理，得到回歸方程為：

2.2 方差分析

表3可知，每一項的顯著性用F值和P值顯示.F值越大和P值越小，表明了該項在方程中顯著性很明顯.由此直接得出，最顯著的項是乙醇濃度（A）項和模型的項，以及乙醇濃度的二次項(A2)、料液比的二次項（B2）、水浴溫度的二次項（C2）、反應(yīng)時間的二次項（D2）、乙醇濃度和水浴溫度的交互項（AC）、乙醇濃度和反應(yīng)時間的交互項（AD）、料液比和反應(yīng)時間的交互項（BD），它們的P值均小于0.0001.其次是料液比（B）項p=0.0072.而反應(yīng)時間的一次項(D)p=0.0176，稍微大于0.01和小于0.05，在此期間也表現(xiàn)出顯著性，因此它對提取黃酮有很大的影響.

表2 提取工藝設(shè)計方案響應(yīng)值及對應(yīng)的預(yù)測值

表3 竹葉中總黃酮提取回歸模型的方差分析

模型的顯著性水平是小于0.0001，此時線性回歸方程模型是極顯著的，說明了該方程與實際情況擬合的比較好，更好的反映了竹葉中總黃酮的得率與乙醇濃度、料液比、水浴溫度、提取反應(yīng)時間的關(guān)系.

結(jié)果表明，利用水浴從竹葉中提取總黃酮，乙醇濃度的變化對黃酮提取量影響最大(p<0.0001)，料液比的影響也非常顯著(p=0.0072)，反應(yīng)時間的影響也相當顯著p=0.0176.

2.3 響應(yīng)面各因素的交互作用分析

利用Design-Expert V8.0.6軟件對試驗結(jié)果進行多元回歸擬合分析處理，得到兩個自變量的三維效應(yīng)曲面圖，通過響應(yīng)面三維圖，從而直觀地反映了各各因素間的交互作用對響應(yīng)值的影響，通過比較1各圖可得：乙醇濃度對黃酮的提取的影響比較顯著，表現(xiàn)為曲線較陡，提取的乙醇濃度最佳值為55%附近，提取的料液比次之，也顯著，其最佳值是1g:35.8mL附近，其后是提取反應(yīng)時間，最佳值是3.48h，而水浴溫度比對黃酮的提取的影響不大，表現(xiàn)為曲線較為平滑的，隨著其含量的增加或減少，它的響應(yīng)值變化較小，其最佳值分別為在水浴溫度72℃左右.

圖1是由多元回歸方程式（1）的擬合方程所做的響應(yīng)曲面圖.由此可對任何兩因素相互影響對竹葉總黃酮的提取進行分析，以確定以總黃酮的得率為響應(yīng)目標的最好的因素水平范圍.

從圖1-A可知，因素C水浴溫度和因素D反應(yīng)時間處于最佳值(分別是70℃，3h)條件下，因素A乙醇濃度和因素B料液比對提取黃酮得率的相互影響.黃酮得率響應(yīng)值隨著因素A和B的水平都從低到高變化，然后再降低，中間存在著一個高響應(yīng)值的范圍，形成了典型的二次曲面.所以，當在乙醇濃度處于48.75%-57.50%左右范圍，料液比控制在1:30g.mL-1左右，可以有較高的得率.

從圖1-B顯示了因素B料液比和因素D反應(yīng)時間在最佳值（分別是1:30g.mL-1，3h）時，因素 A乙醇濃度和因素C水浴溫度對提取黃酮得率的交互影響.從三維曲面圖中可知，有一個比較平緩的二次曲面，在最佳的因素B和D，因素A和B對黃酮得率影響比較平緩.

從圖1-C、圖1-D、圖1-E、圖 1-F可得，一定因素處于最佳值時，其他因素都對提取黃酮得率都有交互影響.雖然二次曲面相對于圖1-A不是很明顯、平緩些，但在控制每個因素時都在較高水平中.

2.4 最佳條件的預(yù)測與驗證試驗

為了更好的確定最佳值，從模型取值范圍內(nèi)選擇出最低點的出發(fā)點，按模型使用快速上升法進行了優(yōu)化[8]，可得知乙醇濃度55%，液料比1g:35.8mL，水浴溫度是72℃，提取反應(yīng)時間是3.48h.此時竹葉總黃酮的得率為1.038%.為了更好驗正Box-Behnken試驗設(shè)計所得出結(jié)果的合理性，采用了上述優(yōu)化提取最佳條件下進行對竹葉總黃酮的水浴提取.5次平行試驗平均總黃酮得率為0.996%，理論值為1.038%.總黃酮的實際值／模型最佳值=0.98，這說明此最佳模型合理有效.對Box-Behnken試驗設(shè)計得出的最佳的結(jié)果具有較好的可靠性.

3 結(jié)論

本實驗是水浴蒸餾法，以竹葉為原料，以蘆丁為標準，Box-Behnken設(shè)計建立了4因素3水平的響應(yīng)面分析，建立乙醇濃度、料液比、水浴溫度、提取的反應(yīng)時間與響應(yīng)值總黃酮得率的交互影響的數(shù)學(xué)模型和回歸方程，繪制了2個自變量的三維響應(yīng)曲面圖，通過目標函數(shù)的二次回歸方程預(yù)測最佳工藝條件，找到整個區(qū)域上各因素的最佳組合和響應(yīng)值的最佳值，從而得出最佳提取工藝條件為乙醇濃度55%，料液比1g:35.8mL，水浴溫度72℃，反應(yīng)時間3.48h，此條件下的黃酮得率為0.996%.總黃酮的得率的實驗值和預(yù)測值相接近，水浴蒸餾法Box-Behnken設(shè)計對提取條件進行優(yōu)化，回歸方程的決定系數(shù)是0.9643，方程較為顯著，擬合較好，精密度好，預(yù)測性較好，合理可行.

〔1〕陸志科,謝碧霞.不同種竹葉的化學(xué)成分及其提取物抗菌活性的研究 [J]西北林學(xué)院學(xué)報,2005,20(1):49-52.

〔2〕張英.竹葉黃酮的生理與藥理活性[J].世界竹藤通訊,2004,2(2):1-11.

〔3〕鄔建敏,賈之慎,唐云湖.竹類黃酮化合物總量及蘆丁含量的測定[J].浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1998,24(4):425-428.

〔4〕宋倩,趙聲蘭,劉彬球,等.響應(yīng)面法優(yōu)化核桃殼總黃酮提取工藝的研究[J].食品工業(yè)科技,2013,34(11):214-217.

〔5〕晏麗,黃美娥,付招.微波正交法提取石榴葉總黃酮工藝[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2010(6):403-404.

〔6〕陳宇,鄧金木,林麗麗,等.竹葉總黃酮提取工藝研究[J].莆田學(xué)院學(xué)報,2012,19(2):38-41.

〔7〕李珍,哈益明,李安,等.響應(yīng)面優(yōu)化蘋果皮渣多酚超聲提取工藝研究 [J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,46(21):4569-4577.

〔8〕王衛(wèi)東,李超,崔恒薇,等.響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取蘆筍黃酮的研究[J].中國食品添加劑,2010(6):72-76.