重組人白細(xì)胞介素－6對膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87增生侵襲的影響

重組人白細(xì)胞介素-6對膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87增生侵襲的影響

劉雅琦顧金海1孟銳安芳玲

(寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏銀川750004)

摘要〔〕目的探討重組人白細(xì)胞介素(IL)-6對膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87增生、侵襲能力的影響及其機(jī)制。方法應(yīng)用CCK-8法檢測IL-6對U87細(xì)胞增生的影響并計(jì)算增殖率；應(yīng)用Transwell小室檢測IL-6對U87侵襲的影響；應(yīng)用Western印跡檢測IL-6對膠質(zhì)瘤細(xì)胞STAT3蛋白及其磷酸化狀態(tài)的影響。結(jié)果IL-6能促進(jìn)U87增生和侵襲能力(P<0.05)，并伴隨STAT3及p-STAT3蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。結(jié)論IL-6通過促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞STAT3磷酸化，從而促進(jìn)了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增生侵襲能力，為腦膠質(zhì)瘤的臨床治療提供了理論支持。

關(guān)鍵詞〔〕白細(xì)胞介素-6；膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87；增生；侵襲

中圖分類號〔〕R739.4〔

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)

通訊作者：顧金海(1974-)，男，博士，副教授，主要從事人腦膠質(zhì)瘤信號通路及癲癇研究。

1寧夏醫(yī)科大學(xué)顱腦疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

第一作者：劉雅琦(1988-)，女，碩士，主要從事人腦膠質(zhì)瘤信號通路研究。

Effects of recombinant human interleukin-6 on the proliferationand invasion of Human U87 Glioma Cells

LIU Ya-Qi,GU Jin-Hai,MENG Rui,etal.

Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,Ningxia,China

Abstract【】ObjectiveTo study the effect of recombinant human interleukin(IL)-6 on proliferation and invasion of Human U87 glioma cells and its mechanism.MethodsCCK-8 assay was used to detect the effect of IL-6 on proliferation of U87 glioma cells,and the relative proliferation effect was calculated.Transwell assay was conducted to study the effect of IL-6 on invasion of U87 glioma cells.Western blot was performed to investigate the change of Stat3 protein and its phosphorylation status after IL-6 treatment.ResultsThe IL-6 promoted the proliferation of U87 glioma cells(P<0.05).The invasion abilities of U87 cells were significantly promoted by IL-6 treatment(P<0.05),which was accompanied by the up-regulation of the STAT3 and p-STAT3 protein expressions.ConclusionsIL-6 could effectively promote U87 glioma cells proliferation and invasion.The phosphorylation of STAT3 might play an important role in this process.

【Key words】Interleukin-6;U87 glioma cells;Proliferation;Invasion

膠質(zhì)瘤患者預(yù)后不良的原因與腦膠質(zhì)瘤生物學(xué)行為有關(guān)。研究表明，白細(xì)胞介素(IL)-6在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié),炎癥反應(yīng),造血調(diào)控等過程中均發(fā)揮重要的作用〔1〕，近年來研究發(fā)現(xiàn)，IL-6在膀胱癌等癌癥的增生中起重要作用〔2〕。IL-6通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的信號通路影響腫瘤細(xì)胞的生長，其中JAK2/STAT3信號通路是其中重要的一條，然而其在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用的具體分子機(jī)制并不十分清晰。本研究擬探討IL-6對膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87活化狀態(tài)及分子生物學(xué)行為的影響及機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87購于上海市吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.1.2主要試劑重組人白介素IL-6購自美國Pepro Tech公司，兔抗人STAT3單克隆抗體和兔抗人STAT3 Phospho(pY705)單克隆抗體購自美國Cell Signal Technology公司，兔抗人GAPDH多克隆抗體(AB-P-R 001)購自杭州賢至生物科技有限公司，辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，Western印跡相關(guān)試劑購自上海雙螺旋生物科技有限公司，發(fā)光液購自美國Advansta公司，全蛋白提取試劑盒和蛋白含量檢測試劑盒購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，CCK-8試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，BD基質(zhì)膠購于美國sigma公司，Transwell小室購于美國Corning公司，細(xì)胞DMEM培養(yǎng)基購自美國HyClone公司，胎牛血清購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.3主要儀器設(shè)備二氧化碳培養(yǎng)箱(上海力新儀器有限公司)；超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；PowerWave XS 全波長酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司)；臺式高速離心機(jī)(上海力新儀器有限公司)；超純水機(jī)(上海力新儀器公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將U87細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素/鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%的CO2恒溫孵育箱中培養(yǎng)，每3 d用0.25%的胰蛋白酶傳代并消化，用對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2蛋白提取及其含量測定將U87培養(yǎng)在60 mm的培養(yǎng)皿中，當(dāng)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞融合至70%～80%時(shí)，加入IL-6處理細(xì)胞(50 ng/ml培養(yǎng)基)30 min，將細(xì)胞用冷PBS洗兩次，再加入適量新配蛋白裂解液(冰上操作)，置于4℃搖床充分裂解15 min，用細(xì)胞刮子刮取細(xì)胞，吸入EP管中，14 000 r/min、4℃離心15 min，取上清液采用BCA法測定蛋白濃度。對照組細(xì)胞做同樣處理。

1.2.3Western印跡檢測目的蛋白根據(jù)STAT3/P-STAT3和GAPDH蛋白分子量的大小(92 kD和37 kD)確定SDS-PAGE分離膠濃度為10%，分離膠凝后加入濃縮膠，待凝固后將終濃度為1.67 μg/μl含有Loading Buffer的蛋白樣品置95℃熱變形8 min，SDS-PAGE膠凝后，將其放入電泳槽，倒入電泳液后輕輕拔出梳子，將煮過的蛋白樣品依次加入加樣孔，每孔15 μl，Maker上樣體積為5 μl。80 V垂直電泳約25～30 min，當(dāng)壓到兩膠界限時(shí)換電壓為110 V繼續(xù)電泳90 min，將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上90 min，用PBST配置的5%牛奶封閉1 h，4℃孵育一抗過夜，STAT3，P-STAT3和GAPDH三種蛋白抗體的濃度依次為1∶500,1∶500,1∶1 000。用PBST洗膜后在辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG孵育二抗室溫下孵育1 h，PBST洗膜后于暗室內(nèi)加入發(fā)光液顯色曝光。圖像用掃描儀記錄，用Gelpro32軟件計(jì)算其灰度值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.4CCK-8法細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)在96孔板中接種1×103個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞懸液體積為100 μl，各組加入IL-6濃度依次為0、25、50 ng/ml，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,每孔加入10 μl WST-8液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育2 h，用酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光度。

1.2.5Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)將BD基質(zhì)膠用無血清培養(yǎng)基稀釋至10 mg/ml,取100 μl鋪在孔徑為8 μm的聚碳酸酯濾膜Transwell小室內(nèi)，避免產(chǎn)生氣泡。置于37℃聚合2 h，將處于對數(shù)生長期的U87細(xì)胞用PBS洗3遍，胰酶消化后用無血清培養(yǎng)基重懸;上室加1×105個(gè)細(xì)胞，總體積200 μl，下室加600 μl含為0、25、50 ng/ml的IL-6及含100 ml/L 胎牛血清的培養(yǎng)基，置37℃，50 ml/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 h； 取出小室，棉簽擦凈上室細(xì)胞并用PBS洗3遍，90%乙醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，PBS清洗3遍； 顯微鏡下取8個(gè)隨機(jī)視野拍照，計(jì)數(shù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS17.0軟件行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1IL-6上調(diào)了U87細(xì)胞中STAT3及p-STAT3蛋白的表達(dá)Western印跡檢測發(fā)現(xiàn)，以GAPDH 為內(nèi)參，經(jīng)過50 ng/ml IL-6處理30 min的U87細(xì)胞，p-STAT3(2.21±0.10)、STAT3(0.86±0.10)表達(dá)水平比較與0 ng/ml IL-6組(1.65±0.04、0.44±0.07)(P<0.05)明顯升高。見圖1。

圖1　IL-6對U87細(xì)胞STAT3及p-STAT3蛋白表達(dá)的影響

2.2U87細(xì)胞的增生狀態(tài)CCK-8結(jié)果顯示，與對照組(0.99±0.11)比較，25、50 ng/ml 組的IL-6可以顯著促進(jìn)U87細(xì)胞的體外增殖(1.37±0.07、1.38±0.36)(P<0.05)，并且該促進(jìn)作用呈一定的劑量依賴關(guān)系。

2.3IL-6促進(jìn)U87細(xì)胞的侵襲Transwell結(jié)果顯示，IL-6處理后的細(xì)胞明顯促進(jìn)了U87細(xì)胞的侵襲(圖2)。在含0、25、50 ng /ml的IL-6及10%FBS的細(xì)胞培養(yǎng)基趨化作用下，細(xì)胞穿膜數(shù)分別為(66±15)個(gè)、(188±20)個(gè)、(336±136)個(gè)，組間比較差異顯著(P<0.05)，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。

圖2　IL-6對U87侵襲作用的影響(×200)

3討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤亦稱膠質(zhì)細(xì)胞瘤，是來源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的原發(fā)性惡性腫瘤，發(fā)病原因尚不完全清楚，占所有顱內(nèi)腫瘤的40%～50%，能夠廣泛高度侵襲周圍正常腦實(shí)質(zhì)〔3，4〕。目前治療膠質(zhì)瘤的方式有手術(shù)、放射治療、化學(xué)治療、基因治療、免疫治療及光動力治療等，但腦膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后仍然不理想，平均生存期十分短暫。

近年來有研究發(fā)現(xiàn)，一些因子及其上下游信號通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中起著重要的作用，其中對STAT3的研究較為突出〔5〕。STAT3作為IL-6信號傳遞中的急性期反應(yīng)因子，位于17q21 染色體上，含有24 個(gè)外顯子，其DNA 全長4 815 bp〔6〕。研究發(fā)現(xiàn)，IL-6可以作為Stat3通路上游的激活信號，促進(jìn)一些腫瘤細(xì)胞的信號活化〔7〕。IL-6不再僅僅只作為一個(gè)炎癥因子參與炎癥疾病的進(jìn)程，而是在促炎和抗炎中扮演著雙重角色，IL-6的表達(dá)失調(diào)會引起嚴(yán)重的疾病，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎〔8〕、前列腺癌〔9〕、肝細(xì)胞癌〔10〕、膀胱癌〔11〕等。然而，膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87不表達(dá)IL-6R〔12〕，我們考慮IL-6是通過與表皮生長因子受體(EGFR)結(jié)合發(fā)揮作用,EGFR是一種重要的具有酪氨酸激酶(RTK)活性的跨膜受體〔13〕，IL-6激活的EGFR會募集許多下游信號，JAK2/STAT信號通路便是其中之一。因此本課題進(jìn)一步探討研究了IL-6在影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87生物學(xué)行為中可能存在的信號通路。

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子家族(STATs)是參與一些細(xì)胞因子以及生長因子介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，在正常細(xì)胞內(nèi)調(diào)控生長、增殖、分化以及凋亡等一系列生理活動〔14〕。然而，STAT3的持續(xù)激活往往會導(dǎo)致生長失調(diào)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的無限增殖、抗凋亡、侵襲、血管再生以及逃脫免疫監(jiān)視。STAT3作為一種關(guān)鍵的細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子，在一些細(xì)胞因子的刺激下，通過酪氨酸酶或絲氨酸酶活化，形成磷酸化的STAT3，進(jìn)而在SH2功能區(qū)相互作用下形成同源或者異源二聚體，進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮其調(diào)節(jié)細(xì)胞生物學(xué)行為的作用。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，前列腺癌細(xì)胞中高表達(dá)磷酸化STAT3 蛋白，且與轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)〔15〕。本研究表明IL-6是膠質(zhì)瘤發(fā)生過程中的一個(gè)重要的細(xì)胞因子，并且與通過STAT3的磷酸化促進(jìn)了膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87的增生侵襲，然而在我們實(shí)驗(yàn)中所發(fā)現(xiàn)的這一機(jī)制應(yīng)該不是簡單的直接的關(guān)系，還有未知的其他分子機(jī)制存在，這為我們今后的進(jìn)一步的研究指明了方向。

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〔2014-09-11修回〕

(編輯郭菁)

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