蘇拉明對腫瘤上清液誘發(fā)的淋巴管內(nèi)皮細胞管腔形成能力的影響

蘇拉明對腫瘤上清液誘發(fā)的淋巴管內(nèi)皮細胞管腔形成能力的影響

徐永良孫平張大偉馮克儉張偉1

(牡丹江醫(yī)學院解剖教研室，黑龍江牡丹江157011)

摘要〔〕目的檢測蘇拉明對肺癌Calu-1細胞上清液誘發(fā)的淋巴管內(nèi)皮細胞管腔形成能力的影響。方法應用免疫熒光染色對淋巴管內(nèi)皮細胞進行鑒定；應用Matrigel立體培養(yǎng)法檢測淋巴管內(nèi)皮細胞管腔形成能力。結果蘇拉明對淋巴管內(nèi)皮細胞的管腔形成能力無顯著影響；腫瘤上清液能夠增強淋巴管內(nèi)皮細胞的管腔形成能力，呈劑量依賴性；而蘇拉明能夠抑制腫瘤上清液誘發(fā)的淋巴管內(nèi)皮細胞的管腔形成，并呈劑量依賴性。結論腫瘤上清液能夠促進淋巴管內(nèi)皮細胞的管腔形成，而蘇拉明能夠抑制這種促進作用。

關鍵詞〔〕蘇拉明；淋巴管內(nèi)皮細胞；腫瘤上清液；管腔形成能力

中圖分類號〔〕R730.2〔

項目基金

通訊作者：張偉(1976-)，男，主治醫(yī)師，碩士，主要從事腫瘤血管和淋巴管生成的分子機制與調控研究。

1牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院

第一作者：徐永良(1978-)，男，碩士，主要從事淋巴管形態(tài)學及其發(fā)生機制的研究。

Impact of the suramin on the ability of lymphatic endothelial cells' tube formation induced by tumor supernatant fluid

XU Yong-Liang, SUN Ping, ZHANG Da-Wei，etal.

Department of Anatomy, Mudanjiang Medical University, Mudanjiang 157011, Heilongjiang, China

Abstract【】ObjectiveTo study the impact of the suramin on the tube formation induced by lung cancer Calu-1 cell supernatant.MethodsCell immunofluorescence was applied to test the lymphatic endothelial cells. Matrigel was used to test the ability of lymphatic endothelial cells' tube formation.ResultsSuramin had little effect on lymphatic endothelial cells' proliferation and the ability of tube formation. Tumor supernatant fluid enhanced the ability of tube formation in a dose-dependent, while suramin inhabited this change caused by tumor supernatant fluid in a dose-dependent.ConclusionsTumor supernatant fluid could promote the tube formation of lymphatic endothelial cells, while suramin could inhabit the tube formation of the lymphatic endothelial cells caused by tumor supernatant fluid.

【Key words】Suramin; Lymphatic endothelial cells; Tumor supernatant fluid; Tube formation

淋巴管是人類癌癥發(fā)生轉移的重要途徑。因此，在淋巴結內(nèi)發(fā)現(xiàn)癌灶是幾乎所有的貌似局限的癌癥預后不良的重要指標。許多的動物模型研究證明，抑制腫瘤局部淋巴結轉移與控制遠隔器官轉移密切相關，說明通過淋巴結轉移至遠隔器官是腫瘤轉移的方式之一〔1〕。Pader等〔2〕的研究認為腫瘤自身的淋巴管對于淋巴轉移的發(fā)生更為重要，腫瘤中央的淋巴管多是無功能的，而腫瘤邊緣的淋巴管對于淋巴轉移的發(fā)生起著重要作用。近10年來，有關腫瘤淋巴管生成的大量實驗研究和臨床研究表明，針對腫瘤淋巴管生成進行靶向治療有可能成為最有效地抑制腫瘤轉移的治療策略。本研究采用了肺癌Calu-1細胞系的上清液誘導淋巴管內(nèi)皮細胞(LEC)的方法，加入蘇拉明，以此來檢測其對腫瘤淋巴管內(nèi)皮細胞管腔形成能力的影響。

1材料與方法

1.1淋巴管內(nèi)皮細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定實驗方法及鑒定結果參照文獻〔3〕。

1.2細胞系肺癌Calu-1細胞系購自中國科學院上海細胞庫。

1.3腫瘤上清液的制備取對數(shù)生長期達到80%融合的腫瘤細胞，采用無血清的DMEM培養(yǎng)，37℃，5%CO2條件下孵育24 h，然后離心并收集上清液，將以1∶4的比例與DMEM混勻備用。

1.4蘇拉明對LEC管腔形成能力影響的檢測首先收集已貼壁的LEC，然后將收集的LEC以5×105/孔的細胞密度接種在事先涂有Matrigel的24孔板中，加入不同濃度(0、100、200、400 μg/ml)的蘇拉明后作用48 h后，應用倒置顯微鏡觀察LEC形成管腔的情況。每孔隨機選取5個視野，并計數(shù)形成管腔的數(shù)目，計算平均值。

1.5腫瘤上清液對LEC管腔形成能力影響的檢測首先收集已貼壁的LEC，然后將收集的LEC以5×105/孔的細胞密度接種在事先涂有Matrigel的24孔板中，分別加入為0%、10%、20%、40%體積分數(shù)的腫瘤細胞上清液，作用48 h后，應用倒置顯微鏡觀察LEC形成管腔的情況。每孔隨機選取5個視野，并計數(shù)形成管腔的數(shù)目，計算平均值。

1.6蘇拉明對腫瘤上清液誘發(fā)的LEC管腔形成能力的影響首先收集已貼壁的LEC，然后將收集的LEC以5×105/孔的細胞密度接種在事先涂有Matrigel的24孔板中，加入體積分數(shù)為40%腫瘤細胞上清液的DMEM。作用12 h后，再分別加入不同濃度0、100、200、400 μg/ml的蘇拉明后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，應用倒置顯微鏡觀察LEC形成管腔的情況。每孔隨機選取5個視野，并計數(shù)形成管腔的數(shù)目，計算平均值。

1.7統(tǒng)計學方法采用SPSS11.0軟件，計量資料組間比較采用t檢驗。

2結果

2.1蘇拉明對LEC管腔形成能力的影響隨著蘇拉明濃度的增加，LEC的管腔形成數(shù)量沒有明顯變化0、100、200、400 μg/ml的蘇拉明作用后，LEC的管腔形成數(shù)量分別為2.333 3±0.816 5，3.133 3±0.516 4，2.566 7±0.169 1，2.666 7±1.211 1。經(jīng)統(tǒng)計學分析，結果顯示各組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明蘇拉明對LEC管腔形成能力沒有影響。見圖1。

圖1　蘇拉明對LEC的管腔形成能力的影響(×100)

2.2腫瘤上清液對LEC管腔形成能力的影響通過成管實驗研究顯示，隨著腫瘤上清液體積分數(shù)的增加，LEC的管腔形成數(shù)量明顯增多，0%、10%、20%、40%體積分數(shù)組LEC管腔形成個數(shù)分別為2.333 3±0.816 5，4.333 3±0.516 4，6.166 7±1.169 1，7.666 7±1.211 1。結果顯示各組間具有顯著差異(P<0.05)，說明腫瘤上清液對LEC管腔形成能力有促進作用，呈濃度依賴性。見圖2。

圖2　腫瘤上清對LEC管腔形成能力的影響(×100)

2.3蘇拉明對腫瘤上清液誘發(fā)的LEC管腔形成能力的影響見圖3。通過成管實驗研究顯示，隨著蘇拉明濃度的增加，腫瘤上清液誘發(fā)的LEC的管腔形成數(shù)量逐漸減少，0、100、200、400 μg/ml蘇拉明作用后，LEC管腔形成個數(shù)分別為6.666 7±1.505 5，3.600 0±0.894 4，2.430 0±0.286 8，1.930 0±0.156 0。結果顯示各組間具有顯著差異(P<0.05)，說明蘇拉明對腫瘤上清液誘發(fā)的LEC管腔形成能力有抑制作用，并呈劑量依賴性。

圖3　蘇拉明對腫瘤上清液誘發(fā)的LEC管腔 形成能力的影響(×100)

3討論

侵襲和轉移是惡性腫瘤患者致死的主要原因。淋巴管是實體腫瘤轉移的最早通路之一，也是影響預后的重要因素。研究表明，腫瘤周圍區(qū)的淋巴管有數(shù)量上的改變，增加了腫瘤細胞淋巴道轉移的機會。鑒于腫瘤淋巴管生成在腫瘤轉移(尤其淋巴道轉移)及腫瘤細胞代謝過程中起著極其重大的作用，研發(fā)和應用淋巴管生成抑制劑對抑制腫瘤的局部淋巴管生成意義重大。通過抑制腫瘤的局部淋巴管生成，阻斷了腫瘤的淋巴道轉移途徑，可以使腫瘤病患病情惡化的概率降低，生活質量得到提升，最終達到延長病患生存期的目的。當前，隨著對腫瘤淋巴管生成機制的深入研究，抗淋巴管生成治療逐步成為抗腫瘤治療中一個新的研究方向。

蘇拉明作為抗腫瘤藥已經(jīng)作用于臨床〔4～6〕。研究發(fā)現(xiàn)，應用蘇拉明抗腫瘤效果較為明顯，蘇拉明與其他抗腫瘤藥還具有協(xié)同作用。蘇拉明不但能抑制腫瘤細胞的增殖，而且能夠通過阻斷生長因子(如VEGF、TGF、PDGF、IGF等)與其受體的相互作用，抑制腫瘤血管的生成〔7〕，達到減少腫瘤組織營養(yǎng)供應，從而抑制腫瘤生長。然而，蘇拉明對腫瘤細胞誘發(fā)的腫瘤淋巴管生成，特別是蘇拉明對淋巴管內(nèi)皮細胞的增殖和管腔形成能力的影響卻未見報道。

本實驗通過腫瘤上清液作用于淋巴管內(nèi)皮細胞模擬體內(nèi)腫瘤狀態(tài)下的淋巴管內(nèi)皮細胞狀態(tài)，進而觀察蘇拉明對腫瘤上清液誘導的淋巴管內(nèi)皮細胞管腔形成能力的影響。結果表明，隨著腫瘤上清液體積分數(shù)的增加，淋巴管內(nèi)皮細胞的管腔形成能力逐漸增強。這表明腫瘤細胞可能是通過釋放一些細胞營養(yǎng)因子這種方式來改變淋巴管內(nèi)皮細胞的生物學狀態(tài)，從而影響其功能。同時，也發(fā)現(xiàn)蘇拉明能抑制這種腫瘤上清液誘發(fā)的淋巴管內(nèi)皮細胞管腔的形成，而蘇拉明對淋巴管內(nèi)皮細胞管腔形成則沒有明顯影響。這些結果說明蘇拉明可能通過阻斷由腫瘤細胞所引起的淋巴管內(nèi)皮細胞活性增強從而達到抑制腫瘤轉移的作用。

當然蘇拉明對淋巴管內(nèi)皮管腔形成能力的影響是否還有其他作用機制，還需進一步實驗證明。本實驗只是初步的細胞水平實驗，有待進一步的深入研究及動物實驗驗證。

4參考文獻

1Krishnan J，Kirkin V，Steffen A，etal.Differential in vivo and in vitro expression of vascular endothelial growth factor(VEGF)-C and VEGF-D in tumors and its relationship to lymphatic metastasis in immunocompetent rats〔J〕.Cancer Res,2003；63(3)：713-22.

2Padera TP，Kadambi A，di Tomaso E，etal.Lymphatic metastasis in the absence of functional intratumor lymphatics〔J〕.Science，2002；296 (5574)：1883-6.

3徐永良.蘇拉明對腫瘤上清液誘導的淋巴管內(nèi)皮細胞增殖的影響〔J〕.牡丹江醫(yī)學院學報，2013;1：3-5.

4Kawakami M，F(xiàn)uruhata T，Kimura Y，etal.Quantification of vascular endothelial growth factor-C and its receptor-3 messenger RNA with real-time quantitative polymerase chain reaction as a predictor of lymphnode metastasis in human colorectal cancer〔J〕．Surgery，2003;133(3)：300-8.

5Schacht V，Ramirez MI，Hong YK，etal.T1〔alpha〕/podoplanin deficiency disrupts normal lymphatic vasculature formation and causes lymphedema〔J〕.EMBO J，2003;22(14)：3546-56.

6王海東，景濤，楊康,等.蘇拉明對食管癌血管生成抑制作用研究〔J〕.消化外科，2005;4(1)：59-61.

7Hall FT，F(xiàn)reeman JL，Asa SL，etal.Intratumoral lymphatics and lymph node metastases in papillary thyroid carcinoma〔J〕.Arch Otolaryngol Head Neck Surg，2003;129(7)：716-9.

〔2015-04-15修回〕

(編輯曲莉)