YAP、LPA及TAZ在頭頸鱗癌中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系

楊海波 黃定強(qiáng) 姜粱

1雅安市人民醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科（四川雅安 625000）；2西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（四川瀘州 646000）

頭頸部惡性腫瘤中以鱗癌最為常見(jiàn)，包括鼻咽癌在內(nèi)，每年均有大量的新發(fā)與死亡病例［1］。盡管現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)飛速發(fā)展，減輕了廣大病患的痛苦，但無(wú)疾病進(jìn)展時(shí)間及總生存時(shí)間并無(wú)顯著提高。該類疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程、腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移、藥物相互作用及耐藥機(jī)制等都成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)［2］。由于特殊解剖位置和毗鄰關(guān)系，治療的各方面限制頗多，病情發(fā)展迅速，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，Hippo?YAP信號(hào)通路上、下游因子如溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid，LPA）等異?？赡茏鳛橐环N致癌因素促使多種惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展［3］，但在涎腺鱗癌中LPA、Yes相關(guān)蛋白（yes?associated protein，YAP）及含PDZ結(jié)合區(qū)的共轉(zhuǎn)錄激活因子（transcriptional co?activator with PDZ?binding motif，TAZ）的相關(guān)研究甚少，本課題從術(shù)后病理標(biāo)本層面進(jìn)行探討，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 組織標(biāo)本 選擇性收集雅安市人民醫(yī)院病理科2010年1月至2016年12月期間，手術(shù)切除的病理組織石蠟標(biāo)本共計(jì)136例，其中包括頭頸鱗癌癌旁正常組織37例、頭頸良性瘤樣組織35例、頭頸鱗癌64例。所有病理組織切片均經(jīng)2位病理科高年資主治醫(yī)師以上人員共同確認(rèn)?；颊吣挲g26～73歲，平均（54.25±7.82）歲，55歲以上者34例，＜55歲者30例；分化由高到低（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級(jí)）分別為15、29、20例；TNM分期：Ⅰ～Ⅳ期分別為10、16、20及18例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有轉(zhuǎn)移36例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有28例。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 兔抗人LPA、YAP及TAZ抗體（西安依科生物公司）、RIPA蛋白及PMSF裂解液（成都貝斯特試劑技術(shù)公司），PMSF、SDS、G250、亞甲基雙丙烯酰胺及總RNA提取試劑盒等（上海潤(rùn)潔化學(xué)技術(shù)有限公司），溴酚藍(lán)（北京蘭伯瑞生物科技公司）。

1.3 免疫組化檢測(cè) 按照LPA、YAP及TAZ免疫組化試劑盒說(shuō)明操作，采用兩步染色法依次包括烘片、脫蠟、抗原修復(fù)、消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性、血清封閉、一抗孵育、二抗孵育、DAB顯色、脫水、透明、封片及結(jié)果判定等。測(cè)定各指標(biāo)在癌旁組織、腺瘤組織和腺樣囊性癌組織中表達(dá)。在40倍鏡下隨機(jī)選四處視野拍照，經(jīng)圖像分析軟件（Image?Pro Plus image）對(duì)采集的圖像行積分吸光度（IOD）分析獲取定量數(shù)值。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR（qRT?PCR）檢測(cè) 按LPA、YAP及TAZ mRNA提取試劑盒說(shuō)明書操作，通過(guò)紫外吸收法檢測(cè)260 nm處吸收峰，計(jì)算得到RNA濃度。將膠置于紫外燈下觀察凝膠并拍照。引物委托北京奧科生物有限公司設(shè)計(jì)及合成YAP、LPA及TAZ和內(nèi)參GAPDH的RT?PCR引物。各自對(duì)應(yīng)的雙向引物（5′?3′）序列：GAPDH，上游：GA GGGAGAAGGTCTGAAT，下游：GATGATGGGGAT GGATTAG；YAP上游：TTGGAGAGTCACAGTACT G，下游：GTTGAAAATGGCCTTGAATA；LPA上游：TAGTCTTCTTGCTCTTAGTGG，下游：TAAGTATCT CGGCAAGAGTA；TAZ上游：CGATCATGTAGCTTG ACTTG，下游：ACCATACTTGTCATCGTCGT。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析所有數(shù)據(jù)。以表示各指標(biāo)，組間比較采用Student′st?test檢驗(yàn)及單因素方差分析，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPA、YAP及TAZ mRNA在頭頸部組織中的表達(dá) 采用實(shí)時(shí)qRT?PCR法檢測(cè)LPA、YAP及TAZ mRNA在不同組織中的表達(dá)并由GAPDH定量（圖1），LPA mRNA在頭頸鱗癌癌旁正常組織、頭頸良性瘤樣組織和頭頸鱗癌組織中的表達(dá)相近（P＞0.05）。YAP mRNA在鱗癌組織中的表達(dá)要高于癌旁組織、瘤樣組織中的表達(dá)（P＜0.05）。TAZ mRNA在頭頸3種組織中呈低表達(dá)，但頭頸鱗癌組織的表達(dá)明顯高于良性瘤樣組織及癌旁正常組織（P＜0.05）。TAZ mRNA在良性瘤樣組織中的表達(dá)亦顯著高于在癌旁正常組織中的表達(dá)（P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.2 LPA、YAP及TAZ蛋白在頭頸組織中的表達(dá) LPA、YAP及TAZ蛋白在絕大多數(shù)組織中都有表達(dá)，主要表達(dá)在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，組化方法測(cè)定，IOD值分析得出YAP和TAZ蛋白在頭頸鱗癌組織中的表達(dá)要顯著高于在癌旁正常組織和瘤樣組織中的表達(dá)（P＜0.05）。而LPA在癌旁正常組織、良性瘤樣組織和鱗癌組織中蛋白的表達(dá)無(wú)明顯差異（P＞0.05），見(jiàn)表2、圖2。

表1 LPA、YAP及TAZ mRNA在頭頸組織中的相對(duì)表達(dá)量的比較Tab.1 Comparison of the relative expression of LPA，YAP and TAZ mRNA in head and neck tissues ±s

表1 LPA、YAP及TAZ mRNA在頭頸組織中的相對(duì)表達(dá)量的比較Tab.1 Comparison of the relative expression of LPA，YAP and TAZ mRNA in head and neck tissues ±s

注：與正常組織比較，*P＜0.05；與良性瘤樣組織比較，▲P＜0.05

組別頭頸癌旁正常組織頭頸良性瘤樣組織頭頸鱗癌組織例數(shù)37 35 64 LPA 0.145±0.032 0.142±0.028 0.143±0.034 YAP 0.154±0.065 0.171±0.086 0.348±0.079*▲TAZ 0.037±0.007 0.053±0.005*0.076±0.006*▲

表2 LPA、YAP及TAZ蛋白mRNA在頭頸組織中的相對(duì)表達(dá)的比較Tab.2 Comparison of the relative expression of LPA，YAP and TAZ mRNA in head and neck tissues ±s

表2 LPA、YAP及TAZ蛋白mRNA在頭頸組織中的相對(duì)表達(dá)的比較Tab.2 Comparison of the relative expression of LPA，YAP and TAZ mRNA in head and neck tissues ±s

注：與正常組織比較，*P＜0.05；與良性瘤樣組織比較，▲P＜0.05

組別頭頸癌旁正常組織頭頸良性瘤樣組織頭頸鱗癌組織例數(shù)37 35 64 LPA 0.420±0.023 0.485±0.035 0.520±0.037 YAP 0.460±0.055 0.478±0.066 0.655±0.060*TAZ 0.284±0.038 0.372±0.036*0.585±0.035*▲

圖2 LPA、YAP及TAZ蛋白在不同頭頸組織中的表達(dá)（×40）Fig.2 LPA,YAP and TAZ protein expression in different head and neck tissues（× 40）

2.3 LPA、YAP及TAZ表達(dá)在頭頸鱗癌中的表達(dá)與患者臨床病理特征相關(guān)性 LPA、YAP及TAZ的表達(dá)與頭頸鱗癌患者臨床病理因素相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)，LPA的表達(dá)與頭頸鱗癌病理特征無(wú)顯著相關(guān)性；鱗癌組織YAP表達(dá)在腫瘤＞3.0 cm、淋巴結(jié)陽(yáng)性中高于腫瘤≤3.0 cm、淋巴結(jié)表達(dá)陰性（P＜0.05）；TAZ的表達(dá)在腫瘤中低分化、腫瘤＞3.0 cm、淋巴結(jié)陽(yáng)性及Ⅲ～Ⅳ期顯著高于腫瘤高分化、腫瘤≤3.0 cm、淋巴結(jié)陰性及Ⅰ～Ⅱ期（P＜0.05），見(jiàn)表3。

3 討論

頭頸部腫瘤中鱗癌（squamous cell carcinoma of head and neck，SCCHN）占 90%［1］，包括喉咽、口腔、鼻咽及下咽癌等，全球每年新發(fā)65萬(wàn)以上。由于特殊解剖位置與比鄰關(guān)系給治療帶來(lái)一定困難。探討頭頸鱗癌相關(guān)的分子標(biāo)志物，為腫瘤的診斷及靶向治療提供思路［4］。LPA是一種存在于唾液和血液并具有多種生物活性的甘油磷脂，能促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［5］。YAP及同源基因——TAZ作為Hippo通路的下游效應(yīng)分子，通過(guò)核內(nèi)調(diào)控基因表達(dá)促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展［6］。YAP與TAZ為同源蛋白，二者在結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能方面高度一致，在多種腫瘤如胰腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞中都觀察到高表達(dá)［7］，然而在涎腺腫瘤報(bào)道甚少。因頭頸腫瘤以鱗癌居多，我們通過(guò)分子生物學(xué)檢測(cè)及臨床病理分析，以探討YAP與TAZ在頭頸鱗癌中所發(fā)揮的作用與相關(guān)性。

表3 LPA、YAP及TAZ在鱗癌中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Tab.3 LPA，YAP and TAZ expression in squamous cell carcinoma were related to clinicopathological features ±s

表3 LPA、YAP及TAZ在鱗癌中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Tab.3 LPA，YAP and TAZ expression in squamous cell carcinoma were related to clinicopathological features ±s

注：與陰性組比較，*P＜0.05

例數(shù)（%）LPA YAP TAZ臨床特征年齡（歲）＜55≥55性別34（53.13）30（46.87）0.125±0.041 0.126±0.038 0.167±0.045 0.162±0.056 0.053±0.018 0.057±0.021男女42（65.62）22（34.38）0.145±0.034 0.147±0.036 0.158±0.037 0.161±0.034 0.037±0.018 0.038±0.020抽煙是否48（75.00）26（25.00）0.124±0.042 0.131±0.038 0.178±0.053 0.184±0.064 0.049±0.026 0.053±0.023飲酒是否27（42.19）37（57.81）0.147±0.025 0.151±0.028 0.191±0.046 0.187±0.052 0.043±0.019 0.039±0.017臨床分期Ⅲ～ⅣⅠ～Ⅱ病理分期中低分化高低分化腫瘤大?。╟m）＞3.0≤3.0淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性陰性26（40.63）38（59.37）0.154±0.037 0.162±0.041 0.172±0.052 0.181±0.060 0.067±0.019*0.042±0.016 23（35.94）41（64.06）0.154±0.037 0.146±0.041 0.167±0.055 0.164±0.049 0.058±0.032*0.031±0.029 30（46.88）34（53.12）0.129±0.027 0.132±0.033 0.287±0.060*0.159±0.056 0.069±0.026*0.047±0.031 28（43.75）36（56.25）0.142±0.034 0.135±0.035 0.369±0.048*0.182±0.045 0.065±0.019*0.043±0.022

本研究發(fā)現(xiàn)TAZ mRNA在頭頸3種組織中呈低表達(dá)，由高到低依次為癌組織、良性瘤樣組織及癌旁正常組織，TAZ的表達(dá)在腫瘤中低分化、腫瘤＞3.0 cm、淋巴結(jié)陽(yáng)性及Ⅲ～Ⅳ期高于腫瘤高分化、腫瘤≤3.0 cm、淋巴結(jié)陰性及Ⅰ～Ⅱ期。AASRUM等［8］探討TGF、EGF信號(hào)對(duì)LPA誘導(dǎo)口腔鱗癌細(xì)胞增殖的影響發(fā)現(xiàn)LPA誘導(dǎo)的口腔鱗癌SAS細(xì)胞的增殖與EGFR活化信號(hào)有關(guān)，而與LPA誘導(dǎo)的TGF?β活化無(wú)關(guān)。DONG等［9］對(duì)口腔鱗癌患者癌標(biāo)本及臨床病理資料相關(guān)性分析，認(rèn)為TAZ陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤大小、腫瘤組織分化程度、淋巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移有關(guān)，Hippo信號(hào)通路參與口腔鱗癌的發(fā)生、發(fā)展。TAZ、P?TAZ等蛋白與口腔鱗癌的預(yù)后情況相關(guān)。CHEN等［10］通過(guò)免疫組化及細(xì)胞培養(yǎng)探討YAP的表達(dá)及與神經(jīng)酰胺作用，發(fā)現(xiàn)YAP蛋白在涎腺鱗癌組織中有較明顯的表達(dá)，而在癌旁正常組織中并無(wú)明顯的表達(dá)，由此說(shuō)明YAP表達(dá)與涎腺鱗癌密切相關(guān)，胞核YAP蛋白的檢測(cè)可考慮作為涎腺鱗癌細(xì)胞生物標(biāo)記或未來(lái)靶向治療的靶標(biāo)。QIU等［11］通過(guò)檢測(cè)喉癌及聲帶息肉組織YAP表達(dá)，發(fā)現(xiàn)YAP表達(dá)主要存在于喉癌和聲帶息肉組織的細(xì)胞核，而磷酸化的YAP多表達(dá)細(xì)胞質(zhì)，喉癌組織中的表達(dá)顯著高于聲帶息肉，且YAP表達(dá)水平與喉癌的惡性程度、病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期呈正相關(guān)，由此說(shuō)明YAP作為癌基因可能參與喉癌發(fā)生、發(fā)展。本課題研究YAP和TAZ蛋白在頭頸鱗癌組織中的表達(dá)要顯著高于在癌旁正常組織和瘤樣組織中的表達(dá)；且在鱗癌中的表達(dá)與腫瘤分化程度、T分期、N分期等密切相關(guān)。GE等［12］通過(guò)免疫組化及組織芯片技術(shù)檢測(cè)YAP在人涎腺良性疾病及鱗癌組織標(biāo)本中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)癌組織中表達(dá)顯著高于良性，且YAP在進(jìn)展期涎腺鱗癌及轉(zhuǎn)移灶中顯著高表達(dá)，這也印證了本課題的實(shí)驗(yàn)。

綜上所述，本研究探討YAP、LPA及TAZ在頭頸鱗癌中的表達(dá)及其與臨床病理意義，認(rèn)為YAP及TAZ在頭頸鱗癌中的表達(dá)與腫瘤分期、分化程度、淋巴結(jié)發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但作用機(jī)制、信號(hào)通路等方面的研究尚欠缺，將是頭頸鱗癌未來(lái)分子診斷、靶向治療深入研究的方向。

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