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    鴨坦布蘇病毒SC2013株的分離鑒定

    2015-12-28 03:41:07周念戴怡雪丁玲玲胡書月李繼祥
    江西畜牧獸醫(yī)雜志 2015年2期
    關(guān)鍵詞:鴨坦布蘇尿囊

    周念,戴怡雪,丁玲玲,胡書月,李繼祥

    (西南大學(xué)榮昌校區(qū),重慶榮昌 402460)

    鴨坦布蘇病毒SC2013株的分離鑒定

    周念,戴怡雪,丁玲玲,胡書月,李繼祥*

    (西南大學(xué)榮昌校區(qū),重慶榮昌 402460)

    利用RT-PCR從疑似鴨坦布蘇病毒感染的致死產(chǎn)蛋鴨的肝、脾和卵泡膜等組織中擴(kuò)增出鴨坦布蘇病毒E基因,并利用10日齡鴨胚分離出病毒SC2013株。該毒株對(duì)氯仿和胰蛋白酶敏感,不凝集雞紅細(xì)胞;E基因核苷酸序列與坦布蘇病毒GX2013G(GenBank:KM275941.1)的相似性在99%以上;對(duì)10日齡鴨胚的半數(shù)致死量為10-4.59/0.2mL,人工接種能引起2日齡雛鴨發(fā)病死亡并呈現(xiàn)典型的臨床癥狀與病理變化。以上結(jié)果表明,分離病毒SC2013株為致病性的鴨坦布蘇病毒,在今后養(yǎng)鴨業(yè)中除注重鴨坦布蘇病毒對(duì)產(chǎn)蛋鴨的危害外,也應(yīng)加強(qiáng)防止幼齡鴨感染。

    坦布蘇病毒;RT-PCR檢測(cè);病毒分離

    坦布蘇病毒(Tembusu virus,TMUV)屬于黃病毒科(Flavivirus)的成員,是經(jīng)蜱、蚊等媒介傳播的蟲媒病毒,最先于1955年從馬來西亞吉隆坡地區(qū)的伊蚊體內(nèi)分離得到,后來在其它地區(qū)的庫蚊中也分離到該病毒(Platt et al,1975)。自2010年以來,我國(guó)東南主要養(yǎng)鴨地區(qū),包括浙江、福建、廣東、江蘇和山東等,出現(xiàn)一種以產(chǎn)蛋鴨產(chǎn)蛋急劇下降,食欲驟減,卵巢出血、變性和壞死為主要特征的傳染病。通過流行病學(xué)調(diào)查、病原分離、動(dòng)物回歸試驗(yàn)、病理學(xué)研究和病毒全基因組測(cè)序,確診該病由一種新的黃病毒引起,并參照病毒分離地將其命名為BYD病毒,疾病命名為鴨產(chǎn)蛋下降綜合征[1]。在我國(guó)水禽業(yè),該病主要發(fā)生于種鴨的產(chǎn)蛋期,但抗體檢測(cè)結(jié)果顯示各個(gè)日齡鴨均可感染,在臨床上出現(xiàn)4周齡櫻桃谷鴨和40日齡金定麻鴨感染發(fā)病的報(bào)道。2011年中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)第一屆水禽疫病防控研討會(huì)正式將該病名統(tǒng)一為“鴨坦布蘇病毒病”,該病病原為一種新型黃病毒即鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)。2013年11月,四川北部地區(qū)某蛋鴨養(yǎng)殖場(chǎng)的160日齡產(chǎn)蛋麻鴨,疑似感染了鴨坦布蘇病毒,本文就該病毒的分離鑒定及特性測(cè)定的結(jié)果報(bào)道如下。

    1 材料與方法

    1.1 病料采集與處理

    2013年11月四川某養(yǎng)鴨場(chǎng)160日齡產(chǎn)蛋麻鴨發(fā)??;臨床表現(xiàn)為采食量和產(chǎn)蛋量急劇下降,在發(fā)病3d內(nèi)采食量下降90%、產(chǎn)蛋率從92%降至10%左右、發(fā)病率幾乎100%、死亡率10%左右;病死鴨的主要病變?yōu)楦文[大、質(zhì)脆,卵泡充血、出血、變性和壞死,脾腫大。無菌采集病死鴨的腦、肝、脾及卵泡膜,混合勻漿后按1∶5(W/V)加入0.01M pH7.2 PBS,反復(fù)凍融3次,14 000rpm離心5min,上清液用于病毒檢測(cè)與分離。

    1.2 鴨坦布蘇病毒的RT-PCR檢測(cè)

    病毒RNA的提取按試劑盒(病毒DNA/RNA提取試劑盒,購(gòu)自大連TaKaRa公司)說明書進(jìn)行。按文獻(xiàn)[2]報(bào)道的序列由上海生工合成引物Fla-1(GCCACGGAATTAGCGGTTGT)和Fla-2(TAATCCTCCATCTCAGCGGTGTAG)以擴(kuò)增鴨坦布蘇病毒E基因約400bp片段。反轉(zhuǎn)錄(RT)以6個(gè)堿基隨機(jī)引物按反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Reverse Trancriptase M-MLV,購(gòu)自大連TaKaRa公司)的說明書進(jìn)行。PCR體系為(25.0μL):10×PCR buffer 2.5 μL、25 mM MgCL22.0 μL、2.5mM dNTP 2.0μL、1.25U rTaq酶0.25μL、10 pM上、下游引物各1.0μL、cDNA模板2.0μL,補(bǔ)充滅菌去離子水至25.0μL;反應(yīng)條件為:94℃5min,94℃30s、57℃30s、72℃30s、40個(gè)循環(huán)后,72℃延伸10min。取PCR產(chǎn)物5.0μL用瓊脂糖凝膠(1.0%瓊脂糖、含熒光染料Glodview)電泳、凝膠成像系統(tǒng)觀察。

    1.3 病毒的分離

    病料處理上清液經(jīng)微孔濾膜(0.22um)除菌并加入雙抗,37℃作用30 min后尿囊腔接種10日齡鴨胚(0.2mL/枚);接種鴨胚37℃孵育,每天照胚2次,連續(xù)觀察7d。收集24h后死亡鴨胚的尿囊液用于鴨胚的連續(xù)傳代至接種鴨胚規(guī)律性死亡,若沒有鴨胚死亡,則在接種后120h隨機(jī)收集3個(gè)鴨胚尿囊液用于連續(xù)傳代。規(guī)律死亡鴨胚尿囊液按1.2檢測(cè)鴨坦布蘇病毒,并按文獻(xiàn)[3~7]的方法檢測(cè)鴨甲肝病毒、禽流感病毒、副粘病毒、鴨瘟病毒、鴨星狀病毒。

    1.4 病毒理化特性測(cè)定

    用1.0%公雞紅細(xì)胞懸液按文獻(xiàn)[8]方法測(cè)定分離病毒感染鴨胚尿囊液的血凝性;同時(shí),按文獻(xiàn)[8]的方法測(cè)定了病毒對(duì)有機(jī)溶劑氯仿、胰蛋白酶的敏感性。

    1.5 坦布蘇病毒E基因克隆及序列分析

    參照GenBank已發(fā)表的鴨坦布蘇病毒基因序列(登錄號(hào)JF270480),設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物Fe-1 (GTTGAGGGAGTGAATG)和Fe-2(TTCTTTCCTAGCCAAGT)用于擴(kuò)增坦布蘇病毒的E基因。分離病毒的鴨胚尿囊液按試劑盒說明書提取病毒RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR的體系(25.0μL)如1.2。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳、切膠回收DNA并利用T載體克隆,上海生工測(cè)序。利用MAGE6.0生物學(xué)軟件的Neighbor-Joining構(gòu)建方法與BYD-1株(JF312912.1)、FS株(JN811558.1)等11株黃病毒E基因核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)分析。

    1.6 對(duì)雛鴨的致病性及病理學(xué)觀察

    2日齡四川麻鴨(重慶永健生物技術(shù)有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基地提供)用于分離病毒的致病性測(cè)定。分離病毒第7代鴨胚尿囊液經(jīng)10倍遞進(jìn)稀釋后腿部肌肉接種,0.2mL/只,每個(gè)稀釋度接種11只;每組動(dòng)物隔離飼養(yǎng),飼喂全價(jià)雛鴨飼料;連續(xù)觀察14d并記錄發(fā)病及死亡情況。瀕臨死亡動(dòng)物解剖,觀察大體病變及采集肝、心、脾等用于組織病理學(xué)觀察和病毒檢測(cè)。

    2 結(jié)果

    2.1 發(fā)病鴨大體病變及鴨坦布蘇病毒檢測(cè)

    將5只送檢病鴨放血致死后解剖,心肌蒼白、質(zhì)地堅(jiān)硬,脾臟腫大,卵泡變性壞死、卵性腹膜炎,肝臟腫大、質(zhì)脆,腦膜充血。利用鮮血營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板沒有從心血、腦、肝、脾和卵泡中分離出致病性細(xì)菌。以鴨坦布蘇病毒E基因設(shè)計(jì)的特異性引物(Fla-1和Fla-2)進(jìn)行RT-PCR檢測(cè),所有送檢鴨病料均檢出400 bp的單一DNA條帶(圖1)。

    圖1 病料中鴨坦布蘇病毒RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳M:DL500 DNA Marker,1:空白對(duì)照,2~6:分別為5個(gè)檢測(cè)樣品

    2.2 病毒的分離、鑒定

    病料處理液接種10日齡鴨胚,接種后40h開始死亡,在120h內(nèi)死亡率76.9%(10/13);將96h死亡胚的尿囊液10倍稀釋后接種,在60~96h鴨胚100% (10/10)死亡;此后死亡胚尿囊液連續(xù)傳代,都能60~108h內(nèi)100%(10/10)致死10日齡鴨胚。第7次接種鴨胚尿囊液(F7)對(duì)10日齡鴨胚的半數(shù)致死量為10-4.59/0.2mL,不凝集雞紅細(xì)胞,經(jīng)5%氯仿和1%胰蛋白酶處理后均不致死10日齡鴨胚,用RT-PCR或PCR檢測(cè)鴨甲肝病毒、禽流感病毒、副粘病毒、鴨瘟病毒、鴨星狀病毒均陰性,RT-PCR檢測(cè)鴨坦布蘇病毒為陽性。

    2.3 坦布蘇病毒E基因的克隆與分析

    圖2 E基因核苷酸序列進(jìn)化樹分析

    以第7次接種鴨胚尿囊液(F7)提取的病毒基因組為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄、鴨坦布蘇病毒E基因特異性引物(Fe-1、Fe-2)進(jìn)行PCR,其產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳、切膠回收DNA、克隆及測(cè)序,獲得1 506bp的核苷酸序列。在NCBI中,利用Blast軟件分析,該核苷酸序列與黃病毒屬的坦布蘇病毒GX2013G(GenBank: KM275941.1)E基因的同源性最高,相似性在99%以上;在氨基酸水平上與CQW1株(GenBank: AIU44176.1)的相似性最高,達(dá)99%以上。以核苷酸序列繪制進(jìn)化樹(見圖2)。

    2.4 SC2013株病毒對(duì)雛鴨的致病性

    分離病毒鴨胚尿囊液(F7)、10倍稀釋及100稀釋后經(jīng)頸部皮下接種2日齡四川麻鴨,死亡率分別為100%、80%和60%;在接種后70h左右發(fā)病,死亡發(fā)生于120h左右。發(fā)病鴨排黃綠色稀糞、行動(dòng)遲緩,后期出現(xiàn)癱瘓、頭頸抽搐等神經(jīng)癥狀。病死鴨腎臟出血及輸卵管尿酸鹽沉積、心臟泛白像水煮樣、脾臟腫大及壞死、腦膜呈樹枝樣出血;肝細(xì)胞顆粒變性及空泡變性,心肌纖維腫脹斷裂、嗜中性白細(xì)胞增多,脾臟淋巴細(xì)胞壞死,腸黏膜上皮細(xì)胞壞死、脫落。死亡鴨腦、肝、心和脾經(jīng)RT-PCR或PCR檢測(cè)為鴨坦布蘇病毒陽性,鴨瘟、鴨甲肝病毒、禽流感病毒副粘病毒和鴨星狀病毒陰性。

    3 討論

    本試驗(yàn)從臨床疑似鴨坦布蘇病毒感染的產(chǎn)蛋鴨組織中分離出無血凝性、對(duì)氯仿和胰蛋白酶敏感的病毒,鴨坦布蘇病毒E基因特性引物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)陽性,而鴨甲肝病毒、流感病毒、副粘病毒和鴨星狀病毒等檢測(cè)陰性,由此表明本試驗(yàn)分離出的病毒SC2013株為鴨坦布蘇病毒。

    自2010年以來,該病毒的感染給我國(guó)的蛋鴨養(yǎng)殖造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。我們將分離的SC2013株病毒人工感染2日齡雛鴨,能引起發(fā)病死亡,并表現(xiàn)出典型的臨床癥狀和病例變化。因此,鴨坦布蘇病毒感染除能引起蛋鴨產(chǎn)蛋下降及死亡以外,在今后的工作中要關(guān)注幼齡鴨的感染。

    [1]Su J,Li S,Hu X,et al.Duck egg-drop syndrome caused by BYD virus,a new tembusu related flavivirus[J].PLoS One, 2011,6(3):1~10.

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    1004-2342(2015)02-0017-03

    S852.65+9.6

    B

    2015-03-17)

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