蛋白激酶受體2與胃癌、幽門螺桿菌感染的關(guān)系研究

蛋白激酶受體2與胃癌、幽門螺桿菌感染的關(guān)系研究

俞敏嚴(yán)曉梅

作者單位:224005鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院(俞敏)；224001 鹽城市第一人民醫(yī)院(嚴(yán)曉梅)

【摘要】目的檢測胃癌組織中H.pylori感染及PAR2的表達(dá)情況，研究PAR2對H.pylori感染小鼠胃粘膜上皮細(xì)胞增殖的影響。方法應(yīng)用Warthin-Starry銀染法，檢測57例胃癌組織與20例癌旁組織中H.pylori感染情況，免疫組織化學(xué)法檢測PAR2的表達(dá)。培養(yǎng)40只SPF級C57BL/6小鼠，隨機分為5組。1組為對照組，以滅菌PBS灌胃；其余4組為實驗組，以H.pylori悉尼株灌胃。分別于末次灌胃后第7、7、14、21、28天將5組小鼠處死后，采用流式細(xì)胞法檢測細(xì)胞周期。結(jié)果胃癌組織H.pylori感染陽性組PAR2表達(dá)水平明顯高于H.pylori感染陰性組與對照組(P<0.05)，H.pylori感染陰性組PAR2表達(dá)水平高于對照組(P<0.05)。小鼠胃粘膜上皮細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)第1組與第2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，第3、4、5組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。PAR2表達(dá)量與PI成正相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論H.pylori感染的胃癌組織中PAR2的表達(dá)更顯著，PAR2可能誘導(dǎo)H.pylori感染小鼠胃粘膜上皮細(xì)胞增殖，與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】蛋白激酶受體2；幽門螺桿菌；胃癌；小鼠；細(xì)胞增殖

基金項目：2012年鹽城市衛(wèi)生局科技計劃項目(編號：YK2012038)

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2015.10.002

中圖分類號：R735.2

收稿日期(2015-06-09修回日期 2015-08-01)

Study of the Correlation between the Expression of PAR2 and Gastric Cancer and Helicobacter Pylori Infection

YUMin，YANXiaomei.YanchengVocationalInstituteofHealthSciences,Yancheng,224005

Abstract【】ObjectiveTo explore the correlation between helicobacter pylori infection and the expression of proteinase activated receptor 2 (PAR2) in gastric cancer tissues,and to study the effect of PAR2 on the proliferation of gastric mucosa epithelial cells of the mice infected by helicobacter pylori.Methods57 cases of gastric cancer tissues were collected to detect helicobacter pylori infection by Warthin-Starry silver staining method,and 20 cases of paracancerous tissues were selected as the controls.The expressions of PAR2 were detected by immunohistochemistry for all cases.40 specific pathogen-free C57BL/6 mice were randomly divided into 5 groups.Group 1 was used as the control group and was taken sterile PBS by intragastric administration,while the other 4 groups were taken helicobacter pylori SS1 suspension by intragastric administration.5 groups of mice were sacrificed after 7,7,14,21,28 days after the last intragastric administration.The expression of PAR2 was detected by immunohistochemistry.Proliferation index (PI)was calculated by flow cytometry.ResultsThe expression rate of PAR2 in helicobacter pylori positive group were significantly higher than those in helicobacter pylori negative group (P<0.05),and the expression rate of PAR2 in gastric cancer tissues were significantly higher than that of control group (P<0.05).The difference between the PI of mice group 1 and 2 had no statistical significance (P>0.05),while the difference among the PI of mice group 3,4 and 5 had statistical significance (P<0.05).The expression of PAR2 and PI were related positively(P<0.05).ConclusionThe expression of PAR2 is higher in gastric cancer tissues infected by helicobacter pylori.PAR2 may induce the proliferation of gastric mucosa epithelial cells,and may be associated with the development of gastric cancer.

【Key words】Proteinase activated receptor 2 (PAR2);Helicobacter pylori;Gastric cancer;Mice;Cell proliferation

(ThePracticalJournalofCancer,2015,30:1426～1429)

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)是定植于人類胃粘膜上皮的Ⅰ類細(xì)菌致癌物，可引起炎性紊亂(如：潰瘍、慢性胃炎等)及惡性腫瘤性疾病(粘膜相關(guān)性淋巴樣組織淋巴瘤和胃癌)[1-2]。蛋白酶激活受體(proteinase activated receptors，PARs)屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，有PAR1-4四個成員。尤其PAR2，可被胰蛋白酶等絲氨酸蛋白酶所激活，在引起不同器官(如：胃粘膜、腸道與胰腺、呼吸道等)的炎癥的發(fā)病機制中起到重要作用[3]，也在人類胃癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤中表達(dá)并參與腫瘤的進(jìn)展。本實驗采集了臨床手術(shù)切除胃癌組織檢測H.pylori感染及PAR2的表達(dá)情況，并通過檢測PAR2在H.pylori SS1感染小鼠胃粘膜上皮細(xì)胞的表達(dá)，探討PAR2與胃粘膜上皮細(xì)胞增殖的關(guān)系。

1材料與方法

1.1材料

57例胃癌與20例癌旁組織標(biāo)本取自鹽城第一人民醫(yī)院手術(shù)切除組織。H.pylori悉尼株(Sydney strain 1，SS1)由鹽城市第一人民醫(yī)院惠贈。40只SPF級C57BL/6小鼠購自南京凱斯艾生物科技有限公司，6～8周齡，均為雄性，體重20～25 g。

1.2胃癌組織H.pylori感染與PAR2表達(dá)的檢測

全部組織標(biāo)本經(jīng)4%甲醛固定，石蠟常規(guī)包埋，制備石蠟切片，切片厚度5 μm，Warthin-Starry銀染檢測胃癌組織與癌旁組織H.pylori感染：脫蠟脫苯后用雙蒸水洗；浸入1%硝酸銀液中，55 ℃孵育30 min；雙蒸水洗后將切片倒入剛配制好的顯影工作液2～4 min，室溫下避免陽光直射，顯影至切片組織呈棕褐色，用55 ℃溫水快速沖洗，脫水透明、中性樹脂封片。免疫組織化學(xué)SP法檢測胃癌組織中PAR2表達(dá)：68 ℃烤片20 min；二甲苯脫蠟，梯度酒精復(fù)水；3%H2O2室溫20 min；置0.01 M枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)中用95 ℃煮沸15 min；滴加5%BSA封閉液，室溫20 min；滴加適當(dāng)稀釋的一抗(1∶50)，4 ℃過夜；PBS洗滌后加生物素化二抗，37 ℃孵育30 min；PBS洗滌后加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，37 ℃孵育30 min；DAB顯色；蘇木精復(fù)染，脫水透明，封片。

1.3H.pylori的培養(yǎng)與菌懸液的制備

復(fù)蘇H.pylori SS1后接種培養(yǎng)于哥倫比亞血瓊脂平板培養(yǎng)基，置于微需氧的培養(yǎng)罐(充滿5%O2、85%N2、10%CO2混合氣體)中，37 ℃培養(yǎng)，每24 h換氣一次。3天后終止培養(yǎng)，以革蘭染色鏡檢和生化試驗鑒定。用滅菌布氏肉湯液體培養(yǎng)基洗下菌苔混合均勻，比濁計調(diào)菌懸液濃度至1.0×109CFU/L。

1.4實驗動物的分組與處理

40只C57BL/6小鼠經(jīng)抗生素預(yù)處理后，隨機分為5組。第1組8只為對照組，用滅菌PBS每天灌胃1次，每次0.5 ml，共5天完成；第2、3、4、5組為實驗組，各組8只，用新鮮H.pylori SS1菌懸液每天灌胃1次，每次0.5 ml，5天完成。第1次灌胃前禁食禁飲12 h，灌胃前0.5 h給予2%碳酸氫鈉液0.2 ml，灌胃后6 h恢復(fù)飲食。分別于最后一次灌胃后第7、7、14、21、28天將第1、2、3、4、5組小鼠處死，處死前禁飲食24 h。

1.5小鼠H.pylori感染的鑒定與胃粘膜上皮細(xì)胞PAR2表達(dá)的檢測

取小鼠胃竇部粘膜組織，1/4用于尿素酶試驗：置于尿素酶試劑中，37 ℃30 min。1/4用于Warthin-Starry銀染：方法同1.2。1/4用于H.pylori培養(yǎng)：將粘膜面在培養(yǎng)基上涂抹，厭氧培養(yǎng)，并以革蘭染色鏡檢和生化試驗鑒定。采用常規(guī)SP法檢測H.pylori感染小鼠胃粘膜上皮細(xì)胞PAR2表達(dá)：方法同1.2，實驗中設(shè)置PBS代替一抗的陰性對照。陽性細(xì)胞胞膜、胞質(zhì)呈棕黃色，根據(jù)圖像分析儀測定的累積光密度值(IOD)判斷結(jié)果。

1.6小鼠胃粘膜上皮細(xì)胞增殖指數(shù)的測定

在無菌培養(yǎng)皿上用手術(shù)刀背刮取小鼠胃粘膜，將其收集于無菌試管內(nèi)；在試管內(nèi)加2 ml新鮮胃蛋白酶，置于37 ℃水浴箱內(nèi)吹打5 min，再加70%冰乙醇固定；將細(xì)胞懸液用300目的尼龍膜過濾，加PI綜合染液，上流式細(xì)胞儀檢測。用公式計算增殖指數(shù)(Proliferation Index，PI)=(S+G2M)/(G0/G1+S+G2M)×100%。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析。計數(shù)資料采用χ2檢驗；計量資料以±s表示，多樣本比較采用One-way ANOVA法進(jìn)行分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1胃癌組織及癌旁組織中PAR2表達(dá)情況

57例胃癌組織中31例H.pylori感染陽性，26例H.pylori感染陰性；20例癌旁組織作為對照組。H.pylori感染陽性組PAR2表達(dá)水平明顯高于H.pylori感染陰性組與對照組(P<0.05)，H.pylori感染陰性組PAR2表達(dá)水平高于對照組(P<0.05)，見表1。

表1　各組胃癌組織及癌旁組織中PAR2表達(dá)情況(例，%)

2.2小鼠H.pylori感染的診斷

經(jīng)尿素酶試驗檢測，試劑由棕黃色變?yōu)榧t色視為陽性；Warthin-Starry銀染，可見H.pylori著棕黑色，胞質(zhì)和粘液著淺黃色；H.pylori培養(yǎng)，可見革蘭染色陰性螺桿菌。三項檢測中一項陽性即判斷為有H.pylori感染，第1組8只均無H.pylori感染，第2、3、4、5組除第3組有1只無感染，其余31只均檢測到H.pylori感染。

2.3小鼠胃粘膜上皮細(xì)胞PAR2免疫組化檢測結(jié)果

第1組與第2、3、4、5組小鼠胃粘膜上皮細(xì)胞PAR2免疫組化IOD值比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，第2組與第3、4、5組比較差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，但第3、4、5組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2　H.pylori感染小鼠胃粘膜上皮細(xì)胞PAR2免疫組化檢測結(jié)果

2.4小鼠胃粘膜上皮細(xì)胞PI值

第1組與第2組小鼠胃粘膜上皮細(xì)胞PI比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，第3、4、5組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。PAR2免疫組化IOD值與PI成正相關(guān)(γ=0.63，P<0.05)。

表3　H.pylori感染小鼠胃粘膜上皮細(xì)胞PI值

3討論

胃癌是1種多因素疾病，某些致癌因素可能在某種特殊菌株的H.pylori感染的基礎(chǔ)上或與其共同作用下導(dǎo)致胃癌[1]。PAR2在胃癌組織中的表達(dá)明顯增加，對胃癌的進(jìn)展有影響[4]。而H.pylori感染的胃粘膜中PAR2又是促炎癥反應(yīng)的介質(zhì)[5]。

本研究的結(jié)果提示PAR2在H.pylori感染性胃癌組織中的表達(dá)明顯高于H.pylori感染陰性胃癌組織與癌旁組織。有研究表明[6-8]H.pylori感染增加了胃粘膜上皮細(xì)胞的凋亡，使上皮細(xì)胞代償性增殖，發(fā)生潛在的癌前病變，可能在致癌過程中起到重要的作用。胃粘膜上皮細(xì)胞的凋亡與增殖的調(diào)節(jié)機制錯綜復(fù)雜，在萎縮性胃炎的腸上皮化生腺體，凋亡與增殖就同時存在于腺體的深層部分。而PAR2的表達(dá)起到阻止細(xì)胞凋亡的作用，它的持續(xù)表達(dá)可能導(dǎo)致胃粘膜上皮細(xì)胞增殖過度，最終引起癌變。Seo等[9-10]認(rèn)為H.pylori誘導(dǎo)PAR2表達(dá)和胰蛋白酶水平與活性增加可能與PAR2相關(guān)性胃粘膜癌變有關(guān)。胰蛋白酶可激活PAR2使胃癌細(xì)胞增殖。H.pylori誘導(dǎo)PAR2的表達(dá)和活化，從而介導(dǎo)COX-2和整合素的表達(dá)。

本研究的結(jié)果還顯示H.pylori感染小鼠PAR2的表達(dá)與胃粘膜上皮細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)呈正相關(guān)，提示PAR2可能誘導(dǎo)H.pylori感染小鼠胃粘膜上皮細(xì)胞增殖。H.pylori的致病機制涉及細(xì)菌因素和宿主因素等，細(xì)菌性因素中存在HtrA(high-temperature requirement A)或其他蛋白酶能激活胃粘膜上皮細(xì)胞的PAR2。Bumann[12]證實H.pylori可分泌一些絲氨酸蛋白酶，如：蛋白酶HtrA，通過PAR2激活胃上皮細(xì)胞。Hoy[13]發(fā)現(xiàn)H.pylori HtrA在高溫和強酸應(yīng)激環(huán)境下高度穩(wěn)定，有助于H.pylori形成持續(xù)感染。而H.pylori感染引起H.pylori相關(guān)性胃炎[14]，持續(xù)數(shù)年至數(shù)十年的慢性萎縮性胃炎是引起胃癌的危險因素[15-16]。因此，PAR2可能在H.pylori感染過程中引起胃粘膜上皮細(xì)胞增殖，與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

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(編輯：吳小紅)