新鮮蛹蟲(chóng)草中SOD的提取工藝優(yōu)化

（廣東海洋大學(xué)理學(xué)院，廣東湛江524088）

蛹蟲(chóng)草（Cordycepsmilitaris），又稱京都蛹蟲(chóng)草、北蟲(chóng)草，是蟲(chóng)、草結(jié)合的藥、食用真菌［1］，具有增強(qiáng)免疫力及抗病功效，其食用、藥用價(jià)值可與冬蟲(chóng)夏草媲美。

超氧化物歧化酶（SOD）是廣泛存在于生物體內(nèi)的金屬酶，不僅能清除生物體內(nèi)超氧陰離子自由基［2］、降低機(jī)體內(nèi)過(guò)氧化脂質(zhì)的生成速度［3］，而且具有消炎及防輻射等功能［4］。因此，SOD 的提取受到研究者的廣泛關(guān)注。作者在此以酶活力為考核指標(biāo)，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)新鮮蛹蟲(chóng)草中SOD 的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，擬為蛹蟲(chóng)草的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮蛹蟲(chóng)草，購(gòu)于江蘇。

三羥甲基氨基甲烷、碳酸鈉、磷酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、考馬斯亮藍(lán)、硫酸銨、鄰苯三酚，分析純，上海試劑廠。

PHS－3C型酸度計(jì)；超聲波清洗機(jī)，新芝生物科技股份有限公司；電子分析天平、UV－2550型紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；TDZ5型低速臺(tái)式自動(dòng)平衡離心機(jī)，赫西儀器裝備有限公司。

1.2 新鮮蛹蟲(chóng)草中SOD 的提取工藝流程

新鮮蛹蟲(chóng)草→研磨→超聲波提取→離心分離→粗提液→離心分離→SOD 粗酶液→純化

稱取0.5g新鮮蛹蟲(chóng)草，研磨，放入燒杯中，加入0.05mol·L－1pH 值為7.8的磷酸緩沖溶液20mL；置于超聲波清洗機(jī)內(nèi)破壁提取20min后，于離心機(jī)中以10 000 r·min－1離心20 min，取上清液，加（NH4）2SO4固體至飽和度達(dá)到42%，再以10 000r·min－1離心10 min，得粗酶液，于冰箱中5 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 提取工藝優(yōu)化

以粗酶液中SOD 的酶活力為考核指標(biāo)，先固定新鮮蛹蟲(chóng)草用量，研究磷酸緩沖溶液用量及pH 值、超聲提取時(shí)間、（NH4）2SO4飽和度4個(gè)因素對(duì)提取效果的影響；再在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，以優(yōu)化新鮮蛹蟲(chóng)草中SOD 的提取工藝條件。

1.4 SOD 酶活力測(cè)定［5］

酶活力單位定義：將在1mL反應(yīng)液中1min抑制鄰苯三酚自氧化速率達(dá)50% 時(shí)的酶量定義為一個(gè)酶活力單位（U·mL－1）：

酶活力＝［（（A0－A1）／A0）／50%］×（Va／V0）×（n／Ve）

式中：A0為對(duì)照管吸光度（自氧化速率）；A1為測(cè)定管吸光度（加入酶后的氧化速率）；n為稀釋倍數(shù)；V0為定義體積，1mL；Va為反應(yīng)總體積，mL；Ve為加入酶體積，mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 磷酸緩沖溶液pH 值對(duì)SOD 酶活力的影響

取新鮮蛹蟲(chóng)草0.5g，固定磷酸緩沖溶液用量為20mL，超聲提取20min，于10 000r·min－1離心20 min，考察磷酸緩沖溶液pH 值（5.0、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、9.0）對(duì)SOD 酶活力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 磷酸緩沖溶液pH 值對(duì)SOD酶活力的影響Fig.1 Effect of pH value of phosphate buffer solution on enzyme activity of SOD

由圖1可看出，隨著磷酸緩沖溶液pH 值的增大，SOD 酶活力先升高后降低，在pH 值為7.8 時(shí)，酶活力達(dá)到最高。因此，磷酸緩沖溶液pH 值選擇7.8較為適宜。

2.1.2 磷酸緩沖溶液用量對(duì)SOD 酶活力的影響

取0.5g新鮮蛹蟲(chóng)草，在pH 值為7.8、不同用量（10 mL、15 mL、20 mL、25 mL、30 mL、35 mL、40 mL、45mL、50mL）磷酸緩沖溶液中超聲提取20min，于10 000r·min－1離心20min，考察磷酸緩沖溶液用量對(duì)SOD 酶活力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 磷酸緩沖溶液用量對(duì)SOD酶活力的影響Fig.2 Effect of dosage of phosphate buffer solution on enzyme activity of SOD

由圖2 可看出，隨著磷酸緩沖溶液用量的增加，SOD酶活力先升高后降低，在用量為30mL 時(shí)，酶活力達(dá)到最高。因此，磷酸緩沖溶液用量選擇30mL 較為適宜。

2.1.3 超聲提取時(shí)間對(duì)SOD 酶活力的影響

取0.5g新鮮蛹蟲(chóng)草，在30 mL pH 值為7.8 的磷酸緩沖溶液中超聲提取不同時(shí)間（0 min、5 min、10min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min），于10 000r·min－1離心20 min，考察超聲提取時(shí)間對(duì)SOD 酶活力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 超聲提取時(shí)間對(duì)SOD 酶活力的影響Fig.3 Effect of ultrasonic extraction time on enzyme activity of SOD

由圖3 可看出，隨著超聲提取時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD 酶活力先升高后降低，在超聲提取時(shí)間為20 min時(shí)，酶活力達(dá)到最高。因此，超聲提取時(shí)間選擇20 min較為適宜。

2.1.4 （NH4）2SO4飽和度對(duì)SOD 酶活力的影響

取0.5g新鮮蛹蟲(chóng)草，在30 mL pH 值為7.8的磷酸緩沖溶液中超聲提取20 min，于10 000r·min－1離心20min，再加入不同飽和度（10%、20%、30%、35%、42%、45%、50%、55%）（NH4）2SO4后，于10 000r·min－1離心10min，考察（NH4）2SO4飽和度對(duì)SOD 酶活力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 （NH4）2SO4飽和度對(duì)SOD酶活力的影響Fig.4 Effect of（NH4）2SO4saturation on enzyme activity of SOD

由圖4可看出，隨著（NH4）2SO4飽和度的增大，SOD 酶活力先升高后降低，在（NH4）2SO4飽和度為42%時(shí)，酶活力達(dá)到最高。因此，（NH4）2SO4飽和度選擇42%較為適宜。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

以SOD 酶活力為考核指標(biāo)，選擇磷酸緩沖溶液用量（A）、磷酸緩沖溶液pH 值（B）、超聲提取時(shí)間（C）、（NH4）2SO4飽和度（D）為考察因素，進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化SOD 提取工藝。正交實(shí)驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1，結(jié)果與分析見(jiàn)表2。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析Tab.2 Results and analysis of orthogonal experiment

由表2可知，各因素對(duì)SOD 酶活力的影響大小依次為磷酸緩沖溶液用量＞超聲提取時(shí)間＞（NH4）2SO4飽和度＞磷酸緩沖溶液pH 值，最優(yōu)提取條件為A2B3C2D2，即新鮮蛹蟲(chóng)草0.5g、磷酸緩沖溶液用量20mL、磷酸緩沖溶液pH 值8.0、超聲提取時(shí)間20 min、（NH4）2SO4飽和度42%，在此條件下，SOD 酶活力達(dá)到最高。

3 結(jié)論

以酶活力為考核指標(biāo)，對(duì)新鮮蛹蟲(chóng)草中超氧化物歧化酶（SOD）的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和L9（34）正交實(shí)驗(yàn)確定新鮮蛹蟲(chóng)草中SOD 的最佳提取條件為：新鮮蛹蟲(chóng)草用量0.5g、磷酸緩沖溶液用量20mL、磷酸緩沖溶液pH 值8.0、超聲提取時(shí)間20 min、（NH4）2SO4飽和度42%，在此條件下，SOD 酶活力最高。

［1］邵力平，沈瑞祥，張素軒，等.真菌分類學(xué)［M］.北京：中國(guó)林業(yè)出版社，1984：109－123.

［2］徐錦堂.中國(guó)藥用真菌學(xué)［M］.北京：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)及北京醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1997：394－401.

［3］敬一兵.蟲(chóng)草［M］.云南：云南科學(xué)技術(shù)出版社，1986：17－35.

［4］俞純方，吳建生，張榮強(qiáng)，等.兔血SOD 的提取及活性研究［J］.西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，17（5）：478－480.

［5］黃維嘉，陳宏礎(chǔ)，黃天祿.鄰苯三酚自氧化抑制法測(cè)定人紅細(xì)胞超氧化物歧化酶［J］.中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，1989，12（4）：206－208.