馬齒莧中總黃酮提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

（湖北民族學院化學與環(huán)境工程學院，湖北恩施445000）

馬齒莧（purslane）為馬齒莧科一年生草本植物，味酸性寒，具有清熱解毒、涼血止血之功效。馬齒莧水提取物對氧化自由基有較好的清除作用［1］，能治療手足癬，具有抗腫瘤、抗衰老［2－3］的功效，對紅細胞膜有保護作用［4］，具有藥理和營養(yǎng)保健作用［5－6］。馬齒莧含有多種化學成分，大多為有機酸類、黃酮類、萜類、香豆素類和生物堿類［7］，其黃酮類化合物［8］多為結(jié)晶性固體，少數(shù)（如黃酮苷類）為無定形粉末，溶解度因結(jié)構(gòu)及存在狀態(tài)（主要是指苷或苷元、糖苷等）不同而有很大差異。馬齒莧總黃酮具有廣泛的生理活性，如保護心血管系統(tǒng)作用、抗肝臟毒作用、抗炎作用、雌性激素樣作用、瀉下作用、抗病毒作用及解痙作用等。作者以蘆丁為對照品，采用分光光度法對馬齒莧中總黃酮進行了測定，并通過單因素實驗和正交實驗對馬齒莧中總黃酮提取工藝進行優(yōu)化；研究了馬齒莧總黃酮的抗氧化活性，并與抗壞血酸（Vc）進行了對比。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

馬齒莧購于恩施宏升大藥房，干燥后置于中藥中速粉碎機中粉碎，經(jīng)無水乙醚脫脂處理后放入紅外干燥儀中烘干，備用。

蘆丁標準品（批號008029705），中國藥品生物制品檢驗所；所用試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；水為二次蒸餾水。

Spectrumlab 22pc型可見分光光度計，上海棱光技術(shù)有限公司；UV－2550型紫外分光光度儀，日本島津制作所；HH－2S 型恒溫水浴鍋，上海天平儀器廠；DW－2型調(diào)溫電熱器，江蘇通州光學儀器有限公司；SHZ－D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵，上海華英儀器有限公司；800型離心機，上海云樓醫(yī)用儀器廠；FA1004B 型電子天平，上海佑科儀器有限公司；RE－52A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 馬齒莧中總黃酮的提取

參照文獻［9－10］對馬齒莧中總黃酮進行提取。提取工藝流程如圖1所示。

1.2.2 標準曲線的繪制

1.2.2.1 最大吸收波長的確定

以50%乙醇、4%氫氧化鈉為溶劑，以亞硝酸鈉、硝酸鋁為顯色劑，對蘆丁與顯色劑所配溶液在200～800nm 之間進行掃描，測得蘆丁標準溶液在500nm處有最大吸收峰。因此，選擇500nm 為馬齒莧提取液中總黃酮的測定波長。

圖1 馬齒莧中總黃酮的提取工藝流程Fig.1 The extraction process of total flavonoids from purslane

1.2.2.2 標準曲線及回歸方程的確定

準確配制0.200 mg·mL－1的蘆丁標準溶液，并精確量取0 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0mL于10mL 容量瓶中，分別加入0.3mL 5%的NaNO2，靜置6 min 后加入0.3 mL 10% 的Al2（NO3）3，靜置6min后加入2mL 4%的NaOH 溶液，靜置10min后加入50%的乙醇定容至10mL，放置20min，在500nm 波長處測定吸光度［9，11］。以吸光度（A）為縱坐標、蘆丁標準溶液的濃度（c）為橫坐標繪制標準曲線。

1.2.3 單因素實驗

準確稱取馬齒莧2.0g于三頸燒瓶中，在設(shè)定條件下回流提取，分別考察提取溶劑種類、提取次數(shù)、水浴溫度、提取時間、固液比對總黃酮提取率的影響，以確定各因素變化范圍和適應(yīng)值。

1.2.4 正交實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以提取時間、水浴溫度、提取溶劑和固液比為考察因素，以馬齒莧總黃酮提取率為考核指標，進行4因素3水平正交實驗，以確定馬齒莧中總黃酮的最優(yōu)提取工藝。

1.2.5 抗氧化活性評價

1.2.5.1 對羥基自由基（·OH）的清除效果

參照文獻［9］，分別用容量瓶量取1 mg·mL－1的馬齒莧總黃酮提取液0.1 mL、0.3 mL、0.6 mL、0.9 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.5 mL、1.8 mL，依次加入1mL的9.0mmol·L－1FeSO4溶液、9.0mmol·L－1水楊酸乙醇溶液、8.8mmol·L－1H2O2溶液，用蒸餾水稀釋至10mL。在37 ℃水浴反應(yīng)30min后，用紫外分光光度計測定510nm 處吸光度（A樣品）?？瞻捉M不加總黃酮提取液，操作同上，測定其吸光度（A空白），樣底中不加H2O2溶液，測定其吸光度（A樣底），按式（1）計算清除率。

用同樣方法配制不同濃度梯度的Vc溶液，測定吸光度，并與總黃酮的清除效果進行對比。

1.2.5.2 對超氧陰離子自由基（·O－2）的清除效果

參照文獻［9］，分別用容量瓶量取1 mg·mL－1的馬齒莧總黃酮提取液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0mL、1.2mL、1.5mL、2.0mL，加入4.5mL pH 值為8.2的0.05mol·L－1Tris－HCl緩沖溶液，用蒸餾水稀釋到6.0mL。于25 ℃水浴預(yù)熱20min，再加入0.4 mL 6.0 mmol·L－1的鄰苯三酚溶液（含有10mmol·L－1的HCl），在25 ℃水浴反應(yīng)4 min后，加入2滴8.0mol·L－1的HCl終止反應(yīng)，并用蒸餾水稀釋至10mL，測定420nm 處吸光度（A樣品）?？瞻捉M不加總黃酮提取液，操作同上，測定吸光度（A空白），用10mol·L－1的HCl代替鄰苯三酚溶液作為樣底，測定吸光度（A樣底），按式（1）計算清除率。

用同樣方法配制不同濃度梯度的Vc溶液，測定吸光度，并與總黃酮的清除效果進行對比。

2 結(jié)果與討論

2.1 蘆丁標準曲線（圖2）

圖2 蘆丁標準曲線Fig.2 The standard curve of rutin

對圖2曲線進行擬合，得回歸方程為A＝0.949c＋0.0002，R2＝0.9992。表明蘆丁濃度在0.016～0.056mg·mL－1之間與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2 單因素實驗

進行預(yù)實驗時，對比了回流提取和索氏提取對提取率的影響。盡管索氏提取提取率稍高，但溶劑消耗量大，后期處理繁瑣。所以，選擇回流提取。

2.2.1 提取溶劑對馬齒莧總黃酮提取率的影響

選用水、乙醇、乙酸乙酯為提取溶劑，在溶劑用量為100mL、水浴溫度為90 ℃、提取時間為50min、提取2次的條件下，考察不同濃度提取溶劑對馬齒莧總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，乙醇和乙酸乙酯對馬齒莧總黃酮的提取效果均優(yōu)于水，且30%乙酸乙酯和70%乙醇的提取效果相當?？紤]到乙醇溶液廉價易得，且使用安全、溶解性好，故選擇70%乙醇為提取溶劑。

圖3 不同濃度提取溶劑對馬齒莧總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of different concentrations of solvent on extraction rate of total flavonoids from purslane

2.2.2 提取次數(shù)對馬齒莧總黃酮提取率的影響

以70%乙醇為提取溶劑，在固液比為1∶50、提取時間為50min、水浴溫度為90 ℃的條件下，考察提取次數(shù)對馬齒莧總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取次數(shù)對馬齒莧總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of extraction times on extraction rate of total flavonoids from purslane

由圖4可知，提取2次的總黃酮提取率較高，但提取次數(shù)過多，提取率提高并不大，且會造成溶劑浪費和提取液純化困難。因此，提取次數(shù)以2次為宜。

2.2.3 水浴溫度對馬齒莧總黃酮提取率的影響

以70%乙醇溶液為提取溶劑，在提取時間為50 min、提取2次的條件下，考察水浴溫度對馬齒莧總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，水浴溫度在60～100℃時，總黃酮提取率隨溫度的升高先升高后降低，在90 ℃時達到最高，為5.61mg·g－1。這是因為，升高溫度有利于溶劑滲透和擴散到組織細胞中，提取率上升；但溫度過高易使黃酮類物質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到破壞，提取率下降。因此，水浴溫度以90 ℃左右為宜。

圖5 水浴溫度對馬齒莧總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of water temperature on extraction rate of total flavonoids from purslane

2.2.4 提取時間對馬齒莧總黃酮提取率的影響

以70%乙醇為提取溶劑，在水浴溫度為90 ℃、提取2次的條件下，考察提取時間對馬齒莧總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 提取時間對馬齒莧總黃酮提取率的影響Fig.6 Effect of extraction time on extraction rate of total flavonoids from purslane

由圖6可知，總黃酮提取率隨提取時間的延長先迅速升高后趨于穩(wěn)定，在提取時間超過50min后，提取率變化不大。這是因為，提取時間過短，溶劑未充分滲透到組織細胞中溶解總黃酮；提取時間過長，原料中的總黃酮向溶液中擴散的速度與溶液中總黃酮向原料中擴散的速度基本達到平衡，提取率趨于穩(wěn)定。故提取時間以50min左右為宜。

2.2.5 固液比對馬齒莧總黃酮提取率的影響

以70%乙醇為提取溶劑，在水浴溫度為90 ℃、提取時間為50min、提取2 次的條件下，考察固液比對馬齒莧總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖7所示。

由圖7可知，固液比在1∶30～1∶50（g∶mL，下同）之間時，隨溶劑量增大，總黃酮提取率呈上升趨勢；當固液比為1∶50時總黃酮提取率達到最高，為5.61 mg·g－1，隨后總黃酮的提取率趨于穩(wěn)定。這是因為，增加溶劑用量有利于總黃酮由原料向提取液中擴散，總黃酮提取率上升；但當溶劑量達到某一值后，提取液與原料表面的總黃酮濃度已達平衡，溶劑中提取原料的副產(chǎn)物也會增多，不利于后續(xù)實驗的進行［12］?？紤]溶劑成本及環(huán)境等因素，固液比以1∶50左右為宜。

圖7 固液比對馬齒莧總黃酮提取率的影響Fig.7 Effect of solid－liquid ratio on extraction rate of total flavonoids from purslane

2.3 正交實驗及驗證實驗

在單因素實驗基礎(chǔ)上，進行L9（34）正交實驗，結(jié)果與分析見表1，方差分析見表2。

表1 正交實驗結(jié)果與分析Tab.1 Results and analysis of orthogonal experiment

表2 方差分析Tab.2 Results of variance analysis

由表1和表2可知，各因素對總黃酮提取率的影響大小依次為：提取溶劑＞水浴溫度＞固液比＞提取時間，最佳提取工藝為A2B2C3D2，即提取時間50 min、水浴溫度90 ℃、提取溶劑為30%乙酸乙酯、固液比1∶50（g∶mL）。

在最佳提取工藝條件下進行驗證實驗，總黃酮提取率為7.15mg·g－1。

2.4 抗氧化活性實驗

2.4.1 馬齒莧總黃酮對·OH 的清除率

Fenton反應(yīng)體系中，雙氧水和亞鐵離子混合后產(chǎn)生·OH，鄰羥基苯甲酸能捕捉·OH 而產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在510nm 處有強吸收。但若往該反應(yīng)體系中加入具有清除·OH 作用的物質(zhì)（如黃酮類物質(zhì)等），其在510nm 處的吸收將減弱或消失［9－10］。依據(jù)此原理，考察馬齒莧總黃酮對·OH 的清除效果，結(jié)果如圖8所示。

圖8 馬齒莧總黃酮對·OH 清除率的影響Fig.8 Effect of total flavonoids from purslane on scavenging rate of·OH

由圖8可看出，馬齒莧總黃酮和Vc對·OH 都具有一定的清除能力，均隨濃度增大而提高，但Vc的清除效果明顯好于馬齒莧總黃酮；當Vc濃度大于0.06 mg·mL－1時，清除率變化不大，均超過92.02%；當馬齒莧總黃酮濃度為0.18 mg·mL－1時，清除率可達73.12%。雖然馬齒莧總黃酮對·OH 的清除率沒有Vc高，但馬齒莧總黃酮為天然抗氧化劑，其安全性相對較高［9－10，13］。

2.4.2 馬齒莧總黃酮對·O－2的清除率

鄰苯三酚在pH 值為8.2 時能夠發(fā)生自氧化反應(yīng)，生成·O－2和有色中間產(chǎn)物，該有色中間產(chǎn)物在420nm 處有強吸收。若抑制·O－2和有色中間產(chǎn)物的生成，其在420nm 處的吸收會減弱［13］，同時鄰苯三酚的自氧化也將受阻。依據(jù)此原理，考察馬齒莧總黃酮對·O－2的清除效果，結(jié)果如圖9所示。

圖9 馬齒莧總黃酮對·O－2 清除率的影響Fig.9 Effect of total flavonoids from purslane on scavenging rate of·O－2

由圖9可看出：馬齒莧總黃酮和Vc對·O－2均有清除能力，且隨濃度增大而提高，但Vc的清除效果優(yōu)于馬齒莧總黃酮；當Vc濃度大于0.08mg·mL－1時，清除效果超過96.02%；馬齒莧總黃酮對·O－2的清除率隨濃度的增大上升緩慢，當濃度為0.20mg·mL－1時，清除率僅為50.23%，但馬齒莧總黃酮的安全性相對較高［9－10，13］。

3 結(jié)論

通過單因素實驗和正交實驗確定馬齒莧中總黃酮的最佳提取工藝為：提取時間50min、水浴溫度90 ℃、提取溶劑為30%乙酸乙酯、固液比1∶50（g∶mL），在此條件下，總黃酮提取率可達7.15mg·g－1。馬齒莧總黃酮對·OH 和·O－2均有清除效果，但相同濃度時Vc清除效果較佳。

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