無需兩性電解質(zhì)的小分子等電聚焦微量制備方法

馮 蕾，趙心怡，趙鳳生

（1.上海交通大學(xué)分析測試中心，上海200240；2.上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海200240）

等電聚焦（isoelectric focusing，IEF）是在一定抗對流介質(zhì)（如凝膠）中加入特殊兩性電解質(zhì)，當(dāng)外加電場時(shí)，兩性電解質(zhì)和兩性樣品開始移動(dòng)，兩性電解質(zhì)最終形成由陽極到陰極pH 值逐步增大的梯度，兩性樣品也被富集在與其等電點(diǎn)（pI）相等的pH 值區(qū)域，從而按照等電點(diǎn)分離。這一技術(shù)的分辨率高，有濃縮效應(yīng)，可以用于許多蛋白質(zhì)樣品的純度分析或分離純化。等電聚焦通常不能進(jìn)行樣品的在線收集，需要將含有樣品的凝膠帶切割后再洗脫，操作繁瑣，耗時(shí)長，所用兩性電解質(zhì)價(jià)格昂貴，限制了其廣泛應(yīng)用，目前主要用于分離等電點(diǎn)接近且價(jià)值較高的蛋白質(zhì)樣品。

近年來，隨著生物醫(yī)藥技術(shù)的飛速發(fā)展，越來越多的極性小分子活性物質(zhì)被發(fā)現(xiàn)，其中，不乏具有兩親性的活性物質(zhì)，例如，水溶性糖肽類抗生素、氨基糖苷類抗生素、活性小肽、小分子核苷酸等。這些物質(zhì)對制備分離技術(shù)提出了新要求［1－3］，由于不能在反相色譜柱上有效保留而不能用常規(guī)液相色譜分離純化［4－6］。對于極性很強(qiáng)的離子型活性物質(zhì)通常采用離子交換色譜進(jìn)行分離［7－8］，但不能同時(shí)分離非極性化合物，高鹽洗脫液還會(huì)增加除鹽負(fù)擔(dān)［9］。親水作用色譜可用于極性或弱極性小分子物質(zhì)的分離分析，但特殊的色譜填料昂貴、有樣品歧視性、抗污染能力差，難以在制備液相色譜中推廣［4－6］。鑒于此，作者建立了一種基于等電點(diǎn)差異分離兩性小分子有機(jī)物的等電聚焦制備技術(shù)，為減少后期處理費(fèi)用、降低成本，使用簡單的酸和堿代替兩性電解質(zhì)；在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)［10－13］上，將普通色譜柱改造；在保持在線洗脫收集的基礎(chǔ)上，在色譜柱上外加電場，為兩性小分子物質(zhì)的分離提供了有效途徑。

1 實(shí)驗(yàn)原理

pH 梯度是等電聚焦的先決條件。首先沿縱向色譜柱（填充普通的抗對流介質(zhì)）灌注pH 值逐漸變化的緩沖溶液，從凝膠柱出口處到入口處pH 值逐漸增大。然后將樣品加到色譜柱入口處，出口處連接電源正極，入口處連接電源負(fù)極，開始通電，并不斷加入具有更大pH 值的緩沖溶液或終止緩沖溶液。被分離兩性物質(zhì)所帶電荷與其pI值和所處環(huán)境pH 值有關(guān)。等電聚焦電泳分離原理示意圖見圖1。

圖1 等電聚焦電泳分離原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of isoelectric focusing electrophoresis

剛上樣時(shí)（圖1A），樣品在床層表面，pI值小于所處環(huán)境pH 值的樣品帶負(fù)電荷，在電場力作用下快速向柱下部移動(dòng)；當(dāng)移動(dòng)到與pI值相同的pH 帶時(shí)（圖1B），移動(dòng)逐漸減慢；若繼續(xù)移動(dòng)到小于pI值的pH 帶時(shí)，帶正電荷，受向上的電場力，向柱入口方向移動(dòng)。如此往復(fù)，最終該樣品聚焦在與其pI值相同的pH 帶上。上樣時(shí)pI值大于所處環(huán)境pH 值的樣品帶正電荷（圖1A），被電場保留在色譜柱床層表面；隨著加入緩沖溶液pH 值的增大，樣品受的電場力逐漸減小，直到加入緩沖溶液pH 值等于或大于其pI值時(shí)（圖1B），樣品隨流動(dòng)相一起進(jìn)入色譜柱。隨著洗脫液的不斷加入，緩沖溶液向下流動(dòng)，pH 梯度會(huì)逐漸向柱下部遷移，最終從色譜柱出口流出，同時(shí)將樣品逐個(gè)洗脫，送入在線檢測裝置和收集器，實(shí)現(xiàn)在線收集。

2 實(shí)驗(yàn)

2.1 材料與儀器

瓊脂糖凝膠Sepharose 6B，Pharmacia Fine Chemicals；頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢吡肟，上海新先鋒藥廠；甲醇（色譜純），上海凌峰試劑廠；其它試劑均為分析純，上海試劑公司。

Agilent 1100系列高效液相系統(tǒng)，安捷倫科技公司；HDL 組合式紫外檢測器及恒流泵，上海金達(dá)生化儀器有限公司。

2.2 實(shí)驗(yàn)裝置及操作方法

將普通色譜柱改造，在保持在線洗脫收集的基礎(chǔ)上，在色譜柱上外加電場，詳見前期工作報(bào)道［10］。色譜柱（40cm×1.2cm I.D.）是帶有冷卻水夾套的玻璃柱，填充瓊脂糖凝膠Sepharose 6B作為分離介質(zhì)。在色譜柱兩端設(shè)置兩個(gè)電極室，通過橡膠管與色譜柱相連。

將0.04 mol·L－1磷酸、0.04 mol·L－1乙酸、0.04mol·L－1硼酸溶液等體積混合作為溶液A，以1mol·L－1氫氧化鈉溶液作為溶液B。將溶液A、B各稀釋50倍后按適當(dāng)比例配制成不同pH 值的緩沖溶液。取該緩沖溶液依次加入色譜柱，形成pH 值單一或逐漸變化的緩沖溶液。將300μL 兩性頭孢菌素樣品混合物（各100μg·mL－1）加到色譜柱入口處。然后不斷加入終止緩沖溶液，分別將陰極和陽極放進(jìn)入口和出口電極室（正向電場），或?qū)㈥枠O和陰極放進(jìn)入口和出口電極室（反向電場），打開電源，設(shè)置電壓為3 000V（電流5～15mA），以不加電場作為參照。色譜柱流出液進(jìn)入出口端電極室，再由蠕動(dòng)泵以一定速度送入檢測裝置和收集器。采用檢測器連續(xù)監(jiān)測流出液的紫外吸收值變化情況，采用收集器分段收集流出液，采用HPLC 分析各種頭孢菌素的濃度，采用pH計(jì)測定pH 值，繪制流出液中頭孢菌素濃度和pH 值隨時(shí)間變化的曲線。

2.3 HPLC色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB C18（250 mm×4.6 mm I.D.，5μm）；流動(dòng)相：甲醇－0.01 mol·L－1NaH2PO4（21∶79，體積比）；流速：1.0 mL·min－1；柱溫：35 ℃；DAD 檢測波長：254nm；進(jìn)樣量：20μL。

3 結(jié)果與討論

3.1 外加電場對pH 梯度的影響

本實(shí)驗(yàn)等電聚焦的pH 梯度是預(yù)先在色譜柱中添加pH 值梯度變化的一系列緩沖溶液產(chǎn)生的，進(jìn)出口電極處的電解反應(yīng)如下：

陽極：2H2O－4e－→4H＋＋O2↑

陰極：4H2O＋4e－→4OH－＋2H2↑

電解產(chǎn)生的氫離子和氫氧根離子會(huì)在電場的作用下作相對運(yùn)動(dòng)，對pH 梯度造成影響［12］。通過測定收集管中pH 值的變化，考察外加電場對色譜柱中pH梯度的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 外加電場對等電聚焦電泳分離頭孢菌素的影響Fig.2 Effects of additional electric fields on separation of cephalosporins by isoelectric focusing electrophoresis

由圖2可看出：外加電場會(huì)通過電極的電解作用影響pH 值的變化，出口的陽極不斷電解生成質(zhì)子，延緩了色譜柱內(nèi)的溶液從酸性到堿性的變化過程，提高了頭孢菌素樣品的分離度（圖2b）；當(dāng)外加反向電場時(shí)（圖2c），起始緩沖溶液pH 值為8.0，緩沖能力差，靠出口處陰極的電解反應(yīng)產(chǎn)生的氫氧根離子不能有效延緩緩沖溶液從堿性到酸性的變化過程，因而不能有效分離樣品。因此，最好選用緩沖能力比較強(qiáng)的緩沖溶液配制pH 梯度預(yù)制溶液，以達(dá)到更好的分離效果。

3.2 外加電場對等電聚焦電泳分離的影響

外加電場是等電聚焦電泳分離樣品的驅(qū)動(dòng)力，外加電場對分離的影響如圖2所示。

由圖2可看出：（1）沒有外加電場時(shí)（圖2a），3種頭孢菌素基本上沒有分開，說明瓊脂糖凝膠對頭孢菌素沒有分離作用，只起到抗對流作用。（2）外加正向電場后（圖2b），頭孢噻肟、頭孢他啶和頭孢吡肟被完全分離。這是因?yàn)椋?種頭孢菌素的側(cè)鏈不同，頭孢吡肟比頭孢噻肟多一個(gè)季銨基團(tuán)，堿性更強(qiáng)；頭孢他啶比頭孢噻肟多一個(gè)季銨基團(tuán)和一個(gè)羧基基團(tuán)，季銨基是強(qiáng)堿基團(tuán)而羧基是弱酸基團(tuán)，因此頭孢他啶的堿性比頭孢噻肟強(qiáng)，比頭孢吡肟弱。出峰順序?yàn)轭^孢噻肟、頭孢他啶、頭孢吡肟，符合分離原理。（3）外加反向電場，并配合從柱的出口到入口pH 值從堿性到酸性梯度變化時(shí)（圖2c），3種頭孢菌素出峰的順序?yàn)轭^孢吡肟、頭孢他啶、頭孢噻肟，即按照等電點(diǎn)依次減小的順序排列。但由于被分離的頭孢菌素主要為偏酸性物質(zhì)，等電聚焦的起始緩沖溶液pH 值為8.0，緩沖能力不足，導(dǎo)致色譜柱中堿性緩沖溶液快速轉(zhuǎn)化為酸性緩沖溶液，柱中緩沖溶液的pH 梯度范圍變窄，3 種頭孢菌素未能分離。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，分離偏酸性的兩性小分子混合物時(shí)，應(yīng)選擇從下往上pH 值從酸性到堿性的變化梯度，并采用色譜柱入口為陰極、出口為陽極的電場方向，以達(dá)到較好的分離效果。

3.3 pH 梯度對等電聚焦電泳分離的影響

3.3.1 不同pH 梯度下頭孢菌素的分離效果

pH 梯度是等電聚焦的必要條件。選用與圖2b相同的分離條件，只改變pH 梯度，考察其對等電聚焦電泳分離的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 pH 梯度對等電聚焦電泳分離頭孢菌素的影響Fig.3 Effects of pH gradient on separation of cephalosporins by isoelectric focusing electrophoresis

由圖3可看出：（1）采用pH 值為5.5的恒定緩沖溶液時(shí)（圖3a），樣品有部分分離。這是因?yàn)椋?種頭孢菌素的等電點(diǎn)存在差異，在pH 值為5.5時(shí)所帶電荷不同，導(dǎo)致電泳遷移速率不同；另外，電極的電解作用在一定程度上使色譜柱出口溶液酸性增強(qiáng)、入口溶液堿性增強(qiáng)，通電一段時(shí)間后，也形成了從入口到出口的pH 值從堿到酸的梯度。但由于缺少有效的預(yù)制pH梯度，樣品聚焦效果不好，出峰很寬，尤其是頭孢吡肟的峰展寬非常嚴(yán)重。當(dāng)pH 梯度均勻變化時(shí)（圖2b），頭孢吡肟的峰明顯增高，說明終止緩沖溶液的堿性已經(jīng)滿足分離要求。（2）采用pH 值逐漸變化的緩沖溶液（圖3b）將pH 值3.0～5.0的梯度變化減緩、pH 值5.0～8.0的梯度變化加快，相當(dāng)于將圖2b的“直線”型pH 梯度變?yōu)椤罢劬€”型pH 梯度。結(jié)果由于pH 值3.0～5.0的梯度長度的增加，使酸性最強(qiáng)的頭孢噻肟受到電場更長時(shí)間的向上作用力，出峰時(shí)間延遲，導(dǎo)致與頭孢他啶的分離度下降；pH 值5.0～8.0的梯度快速上升則增強(qiáng)了頭孢吡肟的聚焦效果，峰型得到有效改善。

3.3.2 不同pH 梯度下頭孢菌素的回收率（表1）

由表1可知，頭孢吡肟的回收率偏低，其余頭孢菌素的回收率可以滿足實(shí)驗(yàn)室制備的需求。表明，提高堿性緩沖溶液的pH 值和堿性緩沖溶液的變化速率可以有效改善聚焦效果，提高頭孢吡肟的回收率；改變pH 梯度可以改變樣品的分離度、聚焦程度和回收率，是該方法的有效調(diào)控參數(shù)。

表1 不同pH 梯度下頭孢菌素的回收率／%Tab.1 Recovery of cephalosporins by different pH gradients／%

4 結(jié)論

用低濃度的酸性和堿性溶液配制成pH 值梯度變化的緩沖溶液，依次添加至填充瓊脂糖凝膠的色譜柱中，形成pH 值從下到上逐漸增大的梯度，在外加電場作用下進(jìn)行等電聚焦電泳，可以按照等電點(diǎn)的不同分離并收集兩性小分子物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，外加電場對pH 梯度有影響，最好選用緩沖能力較強(qiáng)的緩沖溶液配制pH 梯度溶液；改變pH 梯度可以改變兩性小分子物質(zhì)的分離度、聚焦程度和回收率，是有效調(diào)控參數(shù)。該法有望用于兩性新藥或生化產(chǎn)品的實(shí)驗(yàn)室粗分或精制。

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