一株嗜堿原油降解細(xì)菌的篩選及降解能力研究

藍(lán) 慧，陳 帥，曹林友，鄧成剛，王 翀，田 云，盧向陽(yáng)

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方科技學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128；3.湖南省農(nóng)業(yè)生物工程研究所，湖南長(zhǎng)沙410128）

在石油的勘探、開(kāi)采、運(yùn)輸、儲(chǔ)存及生產(chǎn)加工等過(guò)程中漏油事故頻繁發(fā)生，不僅污染土壤，導(dǎo)致土質(zhì)惡化，影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育［1］，而且導(dǎo)致水體中的溶氧量下降，影響水生生物的生長(zhǎng)繁殖［2］。尤其是石油中的多環(huán)芳烴（PAHs）等有毒物質(zhì)具有強(qiáng)烈的致癌、致畸、致突變性，給人類(lèi)健康帶來(lái)巨大危害［3－4］。因此，對(duì)石油污染的治理迫在眉睫。

原油是一種以烴類(lèi)化合物為主的成分復(fù)雜的混合物，包括烷烴、環(huán)烷烴、芳香烴和瀝青質(zhì)化合物［5－6］。當(dāng)前，治理石油污染常用的物理方法和化學(xué)方法均因費(fèi)用昂貴及二次污染而受到限制，而微生物法因經(jīng)濟(jì)、有效、環(huán)保、無(wú)二次污染［7－9］，已被廣泛應(yīng)用于石油污染的治理。目前，已經(jīng)分離到大量的原油降解細(xì)菌，如假單胞菌屬（Pseudomonas）、弧菌屬（Vibrio）、產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）等［10－11］。研究表明，細(xì)菌降解原油的能力強(qiáng)于放線菌、真菌及酵母菌。Zhang等［12］分離篩選出一株銅綠假單胞菌DQ8，在柴油濃度為2%時(shí)，降解率高達(dá)83%，在原油濃度為10%時(shí)，降解率為35%～40%。Yu 等［13］分離出2 株石油降解菌Bacillus subtilisSWH－1 和SphingbacteriummultivorumSWH－2，降解率分別為33.9%和46.3%。El－Sheshtawy等［14］分離出2株原油降解菌PseudomonasxanthomarinaKMM 1447 和PseudomonasstutzerivATCC 17588，降解率為30%～50%。

表面活性劑是一類(lèi)能使溶液體系界面狀態(tài)發(fā)生明顯變化的物質(zhì)，能降低表面張力，提高水溶性［15］。表面活性劑作為乳化劑在石油微生物降解過(guò)程中能提高微生物對(duì)石油的降解率［16－17］。

作者在此從被原油污染的土壤中篩選出一株嗜堿原油降解菌ODB04，對(duì)其進(jìn)行鑒定及生長(zhǎng)條件的優(yōu)化，并在最佳生長(zhǎng)條件下對(duì)其降解能力進(jìn)行研究，為該菌在微生物修復(fù)中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與培養(yǎng)基

土壤樣品采集于被原油污染的土壤；原油購(gòu)于中國(guó)石化。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、瓊脂粉15～20g、蒸餾水1 000mL，pH 值7.0～7.2，121 ℃滅菌20min。

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：參照文獻(xiàn)［17］。

1.2 原油降解菌的富集、分離與純化

在裝有100mL 無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的250mL 三角瓶中，加入5mL土壤樣品浸提液，添加1%原油作為唯一的碳源和能源，置于30 ℃、200r·min－1恒溫?fù)u床培養(yǎng)一周；取10%的富集培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到已添加1%原油的新鮮無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，置于30 ℃、200r·min－1恒溫?fù)u床培養(yǎng)一周，連續(xù)培養(yǎng)3次。取最后一次富集培養(yǎng)液，梯度稀釋至10－5，涂布于含0.1%原油的LB固體平板培養(yǎng)基上，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h；挑取平板上的單菌落進(jìn)行劃線分離純化，最后得到一株原油降解效果明顯的細(xì)菌，命名為ODB04。

1.3 原油降解菌的鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定

通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和生理生化實(shí)驗(yàn)［18－20］，對(duì)細(xì)菌ODB04進(jìn)行鑒定。

1.3.2 16 SrDNA 序列分析

提取細(xì)菌ODB04 總基因組DNA，擴(kuò)增細(xì)菌ODB04的16SrDNA。引物設(shè)計(jì)為：27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG，1492R：GGCTACCTTGTTACGACTT。PCR 反應(yīng)體系：5μL 的10×buffer，0.25μL 的Tap DNAase，4μL 的dNTP，引物各2 μL，2μL的模板，總反應(yīng)體系為50μL。PCR 條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30s，56 ℃退火30s，72 ℃延伸2 min，共32 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物回收后連接到pMD18－T vector上，經(jīng)陽(yáng)性鑒定后送華大基因測(cè)序。

1.4 細(xì)菌ODB04最佳生長(zhǎng)條件的確定

分別測(cè)試細(xì)菌ODB04在不同NaCl濃度（0、1%、2%、4%、6%、8%）、溫度（20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃）和pH 值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0）條件下的生長(zhǎng)情況，每組設(shè)3個(gè)平行，以確定其最佳生長(zhǎng)條件。

1.5 最佳生長(zhǎng)條件下的原油降解率

將細(xì)菌ODB04接種于LB 液體培養(yǎng)基中35 ℃、200r·min－1搖床振蕩培養(yǎng)，待菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，5 000r·min－1離心10min，收集菌體，用無(wú)菌生理鹽水洗滌2次，再用無(wú)菌生理鹽水重懸浮，用分光光度計(jì)測(cè)定OD600＝1.0，備用。

在裝有35mL 含0.5 mL 原油無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的50mL帶蓋三角瓶中，加入2mLOD600＝1.0的菌懸液，在最佳生長(zhǎng)溫度下，200r·min－1搖床振蕩培養(yǎng)7d，以不加菌懸液為對(duì)照，設(shè)3個(gè)平行。振蕩培養(yǎng)7d后，將培養(yǎng)液全部倒入分液漏斗中，加20mL 石油醚振蕩萃取培養(yǎng)液中殘留的原油，重復(fù)振蕩萃取2次，合并萃取液，60 ℃干燥至恒質(zhì)量，稱(chēng)量，用重量法計(jì)算原油降解率。

1.6 最佳生長(zhǎng)條件下表面活性劑對(duì)原油降解率的影響

在最佳生長(zhǎng)條件下，分別測(cè)試0.05%（體積分?jǐn)?shù)，下同）的非離子表面活性劑Tween 80和Triton X－100對(duì)細(xì)菌ODB04原油降解率的影響。以未加表面活性劑為對(duì)照，設(shè)3個(gè)平行。

2 結(jié)果與討論

2.1 原油降解細(xì)菌的篩選與鑒定

以原油作為唯一的碳源和能源，通過(guò)富集培養(yǎng)，分離篩選到具有原油降解能力的細(xì)菌ODB04。對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 原油降解細(xì)菌ODB04的生化特征Tab.1 Biochemical characteristics of crude oil－degrading strain ODB04

進(jìn)一步提取細(xì)菌ODB04的總基因組DNA，用于16SrDNA 擴(kuò)增，電泳圖譜見(jiàn)圖1。

將細(xì)菌ODB04的16SrDNA 序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST 比對(duì)，結(jié)果顯示與克雷伯氏菌屬有99%的同源性。結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化和分子鑒定結(jié)果，并參考伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)，確定原油降解細(xì)菌ODB04屬肺炎克雷伯氏菌（Klebsiellapneumoniae）。

2.2 細(xì)菌ODB04最佳生長(zhǎng)條件的確定

不同的NaCl濃度、溫度、pH 值等會(huì)影響原油的物理狀態(tài)、化學(xué)組成和微生物相關(guān)代謝酶的活性以及

圖1 細(xì)菌ODB04總DNA（a）和16SrDNA擴(kuò)增回收產(chǎn)物（b）的電泳圖譜Fig.1 Electrophorograms of total DNA（a）and 16SrDNA amplified fragments（b）of strain ODB04

微生物生長(zhǎng)過(guò)程中的滲透壓，從而影響對(duì)原油的降解率。NaCl濃度、溫度、pH 值對(duì)原油降解細(xì)菌ODB04生長(zhǎng)的影響見(jiàn)表2。

表2 NaCl濃度、溫度和pH 值對(duì)原油降解細(xì)菌ODB04生長(zhǎng)的影響Tab.2 Effect of NaCl concentration，temperature and pH value on growth of crude oil－degrading strain ODB04

由表2 可見(jiàn)：（1）隨著NaCl濃度的升高，細(xì)菌ODB04的生長(zhǎng)受到抑制，在NaCl濃度高于6%后，細(xì)菌ODB04 不能生長(zhǎng)。因此，確定最佳NaCl濃度為1%～2%。（2）在溫度低于25℃或高于45℃時(shí)，細(xì)菌ODB04的生長(zhǎng)受到抑制。因此，確定最佳生長(zhǎng)溫度為35 ℃。（3）細(xì)菌ODB04不能在酸性條件下生長(zhǎng)，但是pH 值為11.0時(shí)，仍然能夠生長(zhǎng)，說(shuō)明該菌對(duì)堿性的忍耐性很強(qiáng)。確定最佳pH 值為8.0～9.0。

2.3 表面活性劑對(duì)細(xì)菌ODB04的原油降解率的影響

在最佳生長(zhǎng)條件（NaCl濃度為1%～2%、溫度為35 ℃、pH 值為8.0～9.0）下，測(cè)定細(xì)菌ODB04的原油降解率，考察表面活性劑對(duì)原油降解率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 表面活性劑對(duì)細(xì)菌ODB04的原油降解率的影響Fig.2 Effect of surfactant on degradation rate of crude oil for strain ODB04

由圖2可知：（1）培養(yǎng)7d時(shí)，未添加表面活性劑的原油降解率為40%，添加0.05%非離子表面活性劑Tween 80的原油降解率為56%，添加0.05%非離子表面活性劑Triton X－100 對(duì)原油降解率影響不大。（2）在未添加表面活性劑的情況下，5d內(nèi)的原油降解率變化不大，可能是由于原油不溶于無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，特別是在第2d，可以在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中明顯地看到很多小顆粒狀的油滴，阻礙了細(xì)菌ODB04對(duì)原油的降解利用。（3）在添加0.05%非離子表面活性劑Tween 80的情況下，3d 后的原油降解率迅速升高，原因可能是：Tween 80改變了細(xì)菌ODB04細(xì)胞膜的脂肪酸組成，增加了不飽和脂肪酸的含量，提高了細(xì)胞膜的流動(dòng)性，有利于細(xì)菌ODB04 對(duì)原油的降解利用，另外Tween 80能減小表面張力，提高原油的水溶性，從而提高原油的生物利用度［21］。（4）0.05%的非離子表面活性劑Triton X－100 可能對(duì)細(xì)菌ODB04 有毒害作用，因而原油降解率變化不大。

3 結(jié)論

以原油作為唯一的碳源和能源，從被原油污染的土壤中分離得到一株嗜堿原油降解細(xì)菌ODB04，通過(guò)對(duì)該細(xì)菌的形態(tài)學(xué)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)及16SrDNA序列分析，鑒定該菌為肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）。細(xì)菌ODB04的最佳生長(zhǎng)條件為NaCl濃度1%～2%、溫度35 ℃、pH 值8.0～9.0。在該條件下培養(yǎng)7d，細(xì)菌ODB04對(duì)原油的降解率為40%，在添加0.05%非離子表面活性劑Tween 80 的情況下，原油降解率高達(dá)56%，0.05%非離子表面活性劑Triton X－100 對(duì)原油降解率影響不大。表明，細(xì)菌ODB04有很高的原油降解率，具有很強(qiáng)的耐堿能力，對(duì)豐富微生物資源和生物修復(fù)原油污染土壤具有一定的意義。

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