核酸適配體修飾的納米脂質(zhì)體的制備及靶向毒性研究

（蘇州百拓生物技術(shù)服務(wù)有限公司，江蘇蘇州215123）

近年來，癌癥的靶向治療顯示了巨大的應(yīng)用前景。靶向治療分為被動(dòng)靶向和主動(dòng)靶向，被動(dòng)靶向主要是利用腫瘤新生血管通透性比普通血管高，納米載體容易從這些部位滲漏到腫瘤部位，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤部位的藥物富集作用；主動(dòng)靶向是在納米載體的表面修飾一段能特異識(shí)別腫瘤細(xì)胞的抗體、肽、小分子等，使藥物載體能特異識(shí)別并殺傷癌細(xì)胞［1］。脂質(zhì)體是所有載體中應(yīng)用最成功的，而且許多抗癌小分子脂質(zhì)體藥物（如吉西他濱、阿霉素、紫杉醇、順鉑、喜樹堿等）已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化［2］，但還存在著在體液環(huán)境中不穩(wěn)定、藥物未到達(dá)腫瘤部位就突然釋放、腫瘤部位藥物富集量少等缺點(diǎn)。為此，需要對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行進(jìn)一步的修飾，抗體、肽、小分子等可作為細(xì)胞靶向識(shí)別配體修飾在脂質(zhì)體上，以提高藥物載體的特異識(shí)別能力。抗體通常對(duì)配體有很高的親和力，但會(huì)引起很強(qiáng)的免疫反應(yīng)；肽合成容易，不會(huì)引起很強(qiáng)的免疫反應(yīng)，但易被體內(nèi)的酶降解［3］；葉酸、乳糖酸等小分子雖然價(jià)格便宜，體內(nèi)也穩(wěn)定，但沒有很強(qiáng)的靶向性［4－6］。聚乙二醇修飾能大大延長(zhǎng)脂質(zhì)體的血液循環(huán)時(shí)間、避免內(nèi)皮系統(tǒng)的清除作用、提高藥物在腫瘤部位的富集［7］。

適配體（aptamer）因獨(dú)特的生物學(xué)特性已成為靶向治療的熱點(diǎn)。核酸適配體是短的DNA 或RNA 片段，一般由12～30個(gè)堿基構(gòu)成，能特異識(shí)別目標(biāo)分子，而且合成容易、修飾簡(jiǎn)單、儲(chǔ)存和運(yùn)輸方便，在癌癥診療中顯示了巨大的應(yīng)用前景，越來越多的研究用核酸適配體修飾脂質(zhì)體，以進(jìn)一步提高脂質(zhì)體的治療效果［8－12］。美國(guó)FDA 已于2004年批準(zhǔn)了針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的核酸適配體Pegaptanib用于老年眼睛黃斑病變的治療［13］。核酸適配體AS1411是一段26個(gè)核苷酸的單鏈DNA 片段，富含鳥嘌呤，具有非常緊湊的結(jié)構(gòu)和獨(dú)特的生物學(xué)特性，能抵抗血液核酸酶的降解，能以很高的親和力結(jié)合在癌細(xì)胞表面高表達(dá)核素蛋白（nucleolin），是第一個(gè)FDA 批準(zhǔn)用于各種癌癥臨床治療試驗(yàn)的適配體，Antisoma公司已完成了腎癌和急性髓性白血?。╝cute myeloid leukemia，AmL）的二期（phaseⅡa）臨床研究，取得了不錯(cuò)的臨床效果，現(xiàn)正等待審批進(jìn)行下一期（phaseⅡb）臨床研究［14－15］。

鑒于此，作者利用DSPE－PEG2000和核酸適配體修飾的DSPE－PEG5000（DSPE－PEG5000－Aptamer）自組裝構(gòu)建靶向載藥體系（納米脂質(zhì)體），使修飾的核酸適配體充分暴露在載體表面，發(fā)揮識(shí)別細(xì)胞受體的作用，從而提高靶向性；并用乳腺癌細(xì)胞MCF－7（表面高表達(dá)核素蛋白）［16］檢測(cè)該載藥體系的靶向毒性。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與儀器

DSPE－PEG2000（Mw2 700Da）、DSPE－PEG5000－COOH（Mw5 700Da），NanocsInc；1－乙基－3－（3－二甲基氨丙基）－碳化二亞胺（EDC）和N－羥基琥珀酰亞胺（NHS），Sigma－Aldrich；核酸適配體AS1411（100 μmol·mL－1），序列為FAM－5′－（GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG）－3′－NH2，5′端進(jìn)行了FAM 熒光基團(tuán)修飾，3′端進(jìn)行了氨基修飾，由上海生工生物工程股份有限公司合成；鹽酸阿霉素（DOX，Mw579Da），上海生工生物工程股份有限公司；人乳腺癌細(xì)胞MCF－7、非洲綠猴腎細(xì)胞Vero，自行保存；1640培養(yǎng)基、小牛血清，Gibco。

透析袋，Spectrum；WST 細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒，碧云天；流式檢測(cè)凋亡試劑盒Annexin－VFLUOS，Roche；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申勝；探頭式超聲儀，寧波新芝；動(dòng)態(tài)光散射儀，Malvern；熒光顯微鏡，Leica；FC－500型流式細(xì)胞儀，Beckman Coulter。

1.2 DSPE－PEG5000－Aptamer的合成

DSPE－PEG5000－COOH 通過EDC 交聯(lián)，與核酸適配體AS1411反應(yīng)，通過氨基和羧基形成酰胺鍵，從而把AS1411交聯(lián)到DSPE－PEG5000－COOH 上，形成DSPE－PEG5000－Aptamer。合成路線如圖1所示。

圖1 DSPE－PEG5000－Aptamer的合成路線Fig.1 Synthetic route of DSPE－PEG5000－Aptamer

具體過程：按DSPE－PEG5000－COOH∶AS1411∶EDC∶NHS＝1∶1∶5∶1（物質(zhì)的量比，下同）的比例取11.4 mg（2 μmol·L－1）的DSPE－PEG5000－COOH 溶于10mL PBS溶液（pH 值7.4，50mmol·L－1）中，加入10μmol·L－1的EDC，磁力攪拌0.5h，然后加入2μmol·L－1的NHS和AS1411，25 ℃反應(yīng)16h后將反應(yīng)物裝入透析袋（截留分子量10 000）透析24h，除去未反應(yīng)的物質(zhì)，即得DSPE－PEG5000－Aptamer。將合成的 DSPE－PEG5000－Aptamer 用15%的聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）檢測(cè)，上樣量15 μL，再用凝膠成像系統(tǒng)（Bio－Rad）檢測(cè)。

1.3 納米脂質(zhì)體載藥體系的構(gòu)建

先用10mL氯仿溶解54 mg（20μmol·L－1）的DSPE－PEG2000，抽真空狀態(tài)下55 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)4h，使其在瓶壁上形成脂膜；然后按DSPE－PEG2000∶DSPE－PEG5000－Aptamer∶鹽酸阿霉素＝20∶1∶4的比例取5 mL PBS 溶液溶解的DSPE－PEG5000－Aptamer（0.2μmol·L－1），加入2.4 mg（4μmol·L－1）鹽酸阿霉素，充分混勻后加入已成干膜的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中；維持真空0.05MPa、溫度55℃、轉(zhuǎn)速180r·min－1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)2h，使脂膜完全溶解在PBS溶液中，形成微紅的乳液；乳液用超聲儀冰浴超聲（功率200 W，探頭直徑2mm，超聲5s，間隔20s，共超聲10次）后用250nm 的濾膜過濾，即得納米脂質(zhì)體。合成路線如圖2所示。

圖2 納米脂質(zhì)體載藥體系的構(gòu)建及細(xì)胞靶向識(shí)別示意圖Fig.2 Construction of liposome nanocarrier target drug delivery system and scheme of targeted cells recognization

由于DSPE－PEG5000的分子量大，組裝完成后可以使Aptamer充分暴露在載體表面，有利于和細(xì)胞表面的受體結(jié)合，通過受體介導(dǎo)的方式進(jìn)入細(xì)胞而發(fā)揮藥效。

用動(dòng)態(tài)光散射儀檢測(cè)納米脂質(zhì)體粒徑分布。產(chǎn)物進(jìn)行透析，收集透析液，按下式計(jì)算包封率：

1.4 載藥體系對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF－7的靶向毒性

用MCF－7細(xì)胞檢測(cè)載藥體系的靶向毒性，以非洲綠猴腎細(xì)胞Vero為對(duì)照。將細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)板70%左右，用PBS 溶液洗細(xì)胞3次，然后每孔加入無血清培養(yǎng)基100μL，培養(yǎng)2h，設(shè)計(jì)5個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。用于毒性實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞孔先吸出10μL、15μL、20μL、25μL 和50μL的培養(yǎng)液，再分別加入10μL、15μL、20μL、25 μL和50μL的藥物，使培養(yǎng)基的終體積為100μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h。每孔加入10μL WST 溶液，37 ℃孵育2h，測(cè)定450nm 處吸光度。

熒光顯微鏡檢測(cè)載藥體系進(jìn)入細(xì)胞的情況：細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)板70%左右，吸出培養(yǎng)基，用PBS 溶液洗3 次，加入0.5 mL 新鮮的1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)2h，加入20μL藥物孵育4h，用熒光顯微鏡觀察。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況：待培養(yǎng)于6孔板的細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)板70%左右，加入40μL 藥物孵育4h，PBS溶液洗3次，胰酶消化，用1.5mL PBS溶液重懸，2 000r·min－1離心3min，用1mL PBS溶液重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度為1.5×106個(gè)·mL－1，加入5μL的Annexin－V－FLUOS和5μL 的PI染色液，孵育20 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 DSPE－PEG5000－Aptamer的電泳圖譜

由于Aptamer上帶有FAM 基團(tuán)，紫外照射下能發(fā)黃綠色的光。因此，用15%PAGE 對(duì)DSPEPEG5000－Aptamer進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖3。

由圖3可看出，由于Aptamer的交聯(lián)，使DSPEPEG5000在凝膠中遷移受到阻滯（泳道1），而游離的Aptamer在凝膠中遷移較快（泳道2）。表明Aptamer成功交聯(lián)到了DSPE－PEG5000上。

2.2 納米脂質(zhì)體的粒徑分布及包封率

用動(dòng)態(tài)光散射儀檢測(cè)納米脂質(zhì)體的粒徑分布，結(jié)果見圖4。

圖3 DSPE－PEG5000－Aptamer的電泳圖譜Fig.3 Electrophorogram of DSPE－PEG5000－Aptamer

圖4 納米脂質(zhì)體的粒徑分布Fig.4 Particalsize distribution of liposome nanocarrier

由圖4 可看出，納米脂質(zhì)體的平均粒徑為130 nm。

以鹽酸阿霉素濃度（c）為橫坐標(biāo)、OD550（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖5），擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A＝0.01337c＋0.0014，R2＝0.99964。

圖5 鹽酸阿霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of doxorubicin hydrochloride

將納米脂質(zhì)體用透析袋透析后，收集透析液，測(cè)得550nm（鹽酸阿霉素的最大吸收波長(zhǎng)）處吸光度為0.095，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得鹽酸阿霉素濃度為7μg·mL－1，即透析液體系（100 mL）的鹽酸阿霉素含量為700μg（0.7mg），據(jù)此計(jì)算包封率為70.8%。進(jìn)一步算得載藥體系中鹽酸阿霉素的濃度為0.34 mg·mL－1。

2.3 載藥體系進(jìn)入細(xì)胞的情況（圖6）

圖6 載藥體系在乳腺癌細(xì)胞MCF－7（a、b）及正常細(xì)胞Vero（c、d）中的熒光顯微照片F(xiàn)ig.6 Fluorescence microscopy of drug delivery system in breast cancer cell MCF－7（a，b）and normal cell Vero（c，d）

由圖6可看出，在乳腺癌細(xì)胞MCF－7（圖6a、b）中有較強(qiáng)的黃綠熒光（FAM）和紅色熒光（DOX），而在正常細(xì)胞Vero（圖6c、d）中只能見到微弱的熒光，說明構(gòu)建的載藥體系對(duì)癌細(xì)胞有較強(qiáng)的靶向選擇性。

2.4 細(xì)胞的凋亡情況

凋亡試劑Annexin－V－FLUOS主要針對(duì)細(xì)胞膜的磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS），PS在細(xì)胞死亡和凋亡時(shí)從膜內(nèi)外翻到膜外，與Annexin－V－FLUOS結(jié)合后發(fā)綠光，流式檢測(cè)時(shí)為FL1綠光通道（激發(fā)波長(zhǎng)488nm，發(fā)射波長(zhǎng)533nm）；PI不能通過正常和早期凋亡的細(xì)胞膜，但是晚期和死亡的細(xì)胞由于膜受體破壞，PI能通過膜并與細(xì)胞核結(jié)合，發(fā)出紅光，流式檢測(cè)時(shí)為FL2紅光通道（激發(fā)波長(zhǎng)535nm，發(fā)射波長(zhǎng)615nm）。

細(xì)胞經(jīng)藥物和凋亡試劑盒處理后，進(jìn)行流式檢測(cè)，結(jié)果見圖7。

圖7 乳腺癌細(xì)胞MCF－7（a）和正常細(xì)胞Vero（b）的凋亡情況Fig.7 Apoptosis of breast cancer cell MCF－7（a）and normal cell Vero（b）

由圖7 可知，Vero 細(xì)胞經(jīng)過藥物處理4h 后，95.9%的細(xì)胞處于正常細(xì)胞象限E3，而乳腺癌細(xì)胞MCF－7的正常細(xì)胞降低到31.4%（A3象限），死亡細(xì)胞（A1 象限）為50.3%，死亡和凋亡的細(xì)胞（A2）為15.1%。

2.5 藥物的細(xì)胞毒性

用WST 檢測(cè)藥物對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF－7 和正常細(xì)胞Vero的毒性，結(jié)果見圖8。

由圖8可知，藥物對(duì)Vero細(xì)胞活性的影響較小，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞活性下降得比較緩慢；藥物對(duì)MCF－7細(xì)胞活性影響較大，當(dāng)藥物濃度從6.8μg·mL－1（20μL）增加到8.5μg·mL－1（25μL）時(shí)，細(xì)胞活性急劇下降；當(dāng)藥物濃度繼續(xù)增加到17μg·mL－1（50μL）時(shí)，細(xì)胞活性沒有繼續(xù)下降。表明8.5 μg·mL－1的鹽酸阿霉素可以使一個(gè)6孔板的細(xì)胞（約1.5×106個(gè)）發(fā)生凋亡。

圖8 藥物對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF－7和正常細(xì)胞Vero的毒性Fig.8 Drug cytotoxicity on breast cancer cell MCF－7and normal cell Vero

3 結(jié)論

通過核酸適配體修飾，利用聚乙二醇化的DSPE自組裝構(gòu)建了納米脂質(zhì)體靶向載藥體系，并進(jìn)行了載藥體系的靶向毒性研究，納米脂質(zhì)體的平均粒徑為130nm，對(duì)鹽酸阿霉素藥物的包封率為70.8%。組裝材料中DSPE－PEG5000的PEG 鏈比DSPE－PEG2000的長(zhǎng)，可以使適配體充分暴露在載體表面，利于和癌細(xì)胞結(jié)合。載體具有體內(nèi)被動(dòng)靶向作用，即可以通過血液循環(huán)滲漏進(jìn)入細(xì)胞間隙比較大的腫瘤新生血管，從而提高藥物在腫瘤組織的富集濃度。另外，適配體的修飾進(jìn)一步提高了載體對(duì)乳腺癌細(xì)胞的主動(dòng)靶向性，提高了載體進(jìn)入乳腺癌細(xì)胞的能力。研究表明，構(gòu)建的載藥體系對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF－7具有較好的靶向性，所使用的DSPE是FDA 已批準(zhǔn)進(jìn)入臨床的材料，可以加快臨床研究的轉(zhuǎn)化，為開發(fā)乳腺癌的臨床靶向治療藥物奠定了基礎(chǔ)。

［1］SVENSON S.Clinical translation of nanomedicines［J］.Current Opinion in Solid State and Materials Science，2012，16（6）：287－294.

［2］WAGNER A，PLATZGUMMER M，KREISMAYR G，et al.GMP Production of liposomes－A new industrial approach［J］.Journal of Liposome Research，2006，16（3）：311－319.

［3］JIN E L，ZHANG B，SUN X R，et al.Acid－active cell－penetrating peptides forinvivotumor－targeted drug delivery［J］.J Am Chem Soc，2013，135（2）：933－940.

［4］GUO W J，LEE T，SUDIMACK J，et al.Receptor－specific delivery of liposomesviafolate－PEG－chol［J］.Journal of Liposome Research，2000，10（2－3）：179－195.

［5］ZHAO X，LI H，LEE R J.Targeted drug deliveryviafolate receptors［J］.Expert Opin Drug Deliv，2008，5（3）：309－319.

［6］LU Y J，LOW P S.Folate－mediated delivery of macromolecular anticancer therapeutic agents［J］.Advanced Drug Delivery Reviews，2002，54（5）：675－693.

［7］MURA S，BUI D T，COUVREUR P，et al.Lipid prodrug nanocar－riers in cancer therapy［J］.Journal of Controlled Release，2015，208：25－41.

［8］XING H，TANG L，YANG X，et al.Selective delivery of an anticancer drug with aptamer－functionalized liposomes to breast cancer cellsinvitroandinvivo［J］.J Mater Chem B.Mater Biol Med，2013，1（39）：5288－5297.

［9］LI L，HOU J，LIU X，et al.Nucleolin－targeting liposomes guided by aptamer AS1411for the delivery of siRNA for the treatment of malignant melanomas［J］.Biomaterials，2014，35（12）：3840－3850.

［10］CAO Z，TONG R，MISHRA A，et al.Reversible cell－specific drug delivery with aptamer－functionalized liposomes［J］.Angew Chem Int Ed，2009，48（35）：6494－6498.

［11］KANG H，O′DONGOGHUE M B，LIU H，et al.A liposomebased nanostructure for aptamer directed delivery［J］.Chem Commun，2010，46（2）：249－251.

［12］ZHOU J H，ROSSI J J.Cell－specific aptamer－mediated targeted drug delivery［J］.Oligonucleotides，2011，21（1）：1－10.

［13］SUNDAEAM P，KURNIAWAN H，BYRNE M，et al.Therapeutic RNA aptamers in clinical trials［J］.European Journal of Pharmaceutical Sciences，2013，48（1－2）：259－271.

［14］RIZZIERI D，STOCKERL－GOLDSTEIN A，WEI A，et al.Longterm outcomes of responders in a randomized，controlled phaseⅡtrial of aptamer AS1411in AmL［R］.American Society of Clinical Oncology，2010，28：6557.

［15］ROSENBERG J E，DRABKIN H A，LARA P，et al.A phaseⅡ，single－arm study of AS1411in metastatic renal cell carcinoma（RCC）［R］.American Society of Clinical Oncology，2010，28：4590.

［16］SOUNDARARGJAN S，CHEN W，SPICER E K，et al.The nucleolin targeting aptamer AS1411destabilizes Bcl－2 messenger RNA in human breast cancer cells［J］.Cancer Research，2008，68（7）：2358－2365.