匹伐他汀對(duì)大鼠心肌缺血再灌注后氧化應(yīng)激作用的影響

尤　楊，馮　倩，夏　岳*，戚國(guó)慶，張　燕，張慶文

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院心內(nèi)三科,河北 石家莊 050031;

2.河北省張家口市第一醫(yī)院心內(nèi)三科,河北 張家口 075000)

·論著·

匹伐他汀對(duì)大鼠心肌缺血再灌注后氧化應(yīng)激作用的影響

尤楊1，馮倩2，夏岳1*，戚國(guó)慶1，張燕1，張慶文1

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院心內(nèi)三科,河北 石家莊 050031;

2.河北省張家口市第一醫(yī)院心內(nèi)三科,河北 張家口 075000)

[關(guān)鍵詞]心肌再灌注損傷；匹伐他汀；氧化性應(yīng)激

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.04.001

對(duì)于急性心肌梗死患者，盡早開通梗死動(dòng)脈，迅速而持久地恢復(fù)梗死動(dòng)脈的前向血流，對(duì)于挽救瀕臨死亡的心肌、防止擴(kuò)大梗死面積、保護(hù)心肌的泵血功能、提高早期存活率和降低病死率有著極其重要的意義。而缺血心肌在一定時(shí)間內(nèi)恢復(fù)血液再灌注后，原心功能不僅沒(méi)有恢復(fù)，反而出現(xiàn)了使功能代謝障礙及結(jié)構(gòu)破壞進(jìn)一步加重的現(xiàn)象，即心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)[1]。其機(jī)制尚未明確，目前已成為困擾臨床診療效果的重要問(wèn)題以及研究熱點(diǎn)。他汀類藥物，即3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A抑制劑，是目前臨床上應(yīng)用最廣泛的調(diào)脂藥物，且在防治MIRI的研究中，其顯示出多種機(jī)制的心臟保護(hù)作用。本研究通過(guò)制作匹伐他汀預(yù)處理的大鼠心肌缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)模型，觀察匹伐他汀預(yù)處理是否能減輕大鼠MIRI，縮小心肌梗死面積，并進(jìn)一步探討其機(jī)制，旨在為他汀類藥物在干預(yù)缺血再灌注心肌的臨床應(yīng)用上提供更多的理論依據(jù)。報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年雄性清潔級(jí)SD大鼠42只，體質(zhì)量(250±20) g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為醫(yī)動(dòng)字第04037，動(dòng)物等級(jí)為無(wú)特定病原體動(dòng)物。將42只SD大鼠隨機(jī)分為3組各14只，術(shù)前3個(gè)組均于每日上午8:30~9:30，25 ℃室溫下以生理鹽水等量等溫灌胃，1次/d。假手術(shù)組(Sham組)生理鹽水2 mL/d灌胃4周，術(shù)中冠狀動(dòng)脈的左前降支(left anterior descending，LAD)下只穿線，不結(jié)扎，也不再灌注。IR組生理鹽水2 mL/d灌胃4周，術(shù)中結(jié)扎LAD 30 min，再松解120 min，建立IR模型。匹伐他汀組(Statin組)術(shù)前匹伐他汀0.42 mg·kg-1·d-1用生理鹽水溶解成2 mL，1次/d，灌胃4周，建模過(guò)程同IR組。

1.2主要試劑超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程公司)；BAC蛋白定量試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme-MB,CK-MB)檢測(cè)試劑(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科提供)；伊文思藍(lán)(美國(guó)Sigma公司)；氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC，美國(guó)Sigma公司)；10%水合氯醛(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室)；10%福爾馬林溶液(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室)；總蛋白提取(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室自行配制)；抑肽酶(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供)；匹伐他汀片劑(2 mg/片，日本興和株式會(huì)社)。主要儀器：ECG-9620P三道自動(dòng)分析心電圖機(jī)(上海光電醫(yī)用電子儀器有限公司)；HX-3實(shí)驗(yàn)用人工呼吸機(jī)(正達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)公司)；手術(shù)器械、7/0Prolene線(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院手術(shù)室)；顆粒制冰機(jī)(青島阿伊斯曼公司)；電子天平(德國(guó)Sartorius AG公司)；SBHW-Ⅳ電熱恒溫水浴箱(北京市醫(yī)療設(shè)備廠)；LDZ5-2型低速自動(dòng)平衡離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；Centrifuge 5417R低溫離心機(jī)(德國(guó)制造)；JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝科器研究所)；-80 ℃冰箱(日本三洋公司)；-20 ℃冰箱(青島伊萊克斯有限公司)；UNICEL DXC800全自動(dòng)生化分析儀(德國(guó)BECKMAN COULTER公司)；722型分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)。

1.3方法參照文獻(xiàn)[2-3]的方法制作模型。經(jīng)10%水合氯醛以3 mL/kg腹腔注射麻醉，氣管插管，接人工呼吸機(jī)。以針式電極插入實(shí)驗(yàn)大鼠四肢皮下，尾端連接于心電圖相應(yīng)的肢體導(dǎo)聯(lián)線上，以Ⅱ?qū)?lián)記錄，記錄正常心電圖(紙速100 mm/s,電壓20 mm/mV)作為對(duì)照。開胸，使左心耳與肺動(dòng)脈圓錐之間的心大靜脈清晰可見(jiàn)，以此靜脈為標(biāo)志，結(jié)扎LAD。先在結(jié)扎線下放1根1 mm的乳膠管，結(jié)扎過(guò)程中觀察心肌顏色變化，結(jié)扎LAD造成左心室前壁心肌缺血30 min，然后松線再灌注120 min。模型制作成功標(biāo)準(zhǔn)：以結(jié)扎LAD后左心室前壁局部心肌立刻由鮮紅變深、發(fā)紺，心電圖顯示ST段弓背向上抬高≥0.2 mV，T波電壓進(jìn)行性增高，或QRS波幅升高及時(shí)限增寬作為結(jié)扎成功標(biāo)準(zhǔn)；松開結(jié)扎線恢復(fù)冠狀動(dòng)脈血流，以缺血部位心肌顏色恢復(fù)，T波迅速回落、ST段驟降50%以上作為L(zhǎng)AD成功再通標(biāo)準(zhǔn)。

1.4觀測(cè)指標(biāo)①大鼠實(shí)驗(yàn)前后心電圖變化；②各組隨機(jī)抽取7只大鼠用于心肌梗死面積的測(cè)定，于實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)間點(diǎn)再次原位結(jié)扎LAD，左心室內(nèi)注射5%伊文思藍(lán)溶液1 mL，確定缺血區(qū)(無(wú)藍(lán)色)和非缺血區(qū)(藍(lán)色)，待大鼠口唇藍(lán)紫后迅速取左心室，垂直心室長(zhǎng)軸切除心尖端3 mm厚心肌，其余心肌組織置-20 ℃冰箱冷凍30 min，然后自心尖向心底部垂直心室長(zhǎng)軸切成厚2 mm切片4~5片，置1% TTC溶液中，在37 ℃恒溫水浴箱中避光孵浴10~15 min以區(qū)分缺血區(qū)及梗死區(qū)，以10%福爾馬林溶液固定24 h以增強(qiáng)染色顏色對(duì)比。以朝向心尖部的切面作為面積分析切面，藍(lán)色為正常心肌，淺紅色為缺血心肌，灰白色為梗死心肌，通過(guò)計(jì)算機(jī)分析軟件測(cè)定梗死區(qū)面積(area of necrosis，AN)，以心臟總梗死區(qū)面積占總危險(xiǎn)區(qū)面積(area at risk，AAR，即缺血區(qū)與梗死區(qū)面積之和)的百分比(AN/AAR)表示梗死面積，以危險(xiǎn)區(qū)面積占左心室面積(left ventricle，LV)的百分比(AAR/LV)表示危險(xiǎn)區(qū)面積。其余7只大鼠留取血液及心肌組織樣本：于實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)間點(diǎn)迅速開腹，下腔靜脈取血2 mL加入促凝管,室溫靜置并離心后，吸取上層血清，-20 ℃冰箱中保存，采用UNICEL DXC800全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定CK-MB含量；取血成功后立即垂直心室長(zhǎng)軸切取結(jié)扎線以下所有心肌組織，液氮速凍后稱質(zhì)量，于-80 ℃冰箱中保存，以黃嘌呤氧化酶法測(cè)總超氧化物岐化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)活性。

2結(jié)果

2.1心電圖變化結(jié)扎LAD前大鼠Ⅱ?qū)?lián)心電圖顯示心律規(guī)整，無(wú)ST-T、QRS波的改變；成功結(jié)扎大鼠LAD后，心電圖出現(xiàn)QRS波群增寬，ST段迅速弓背向上抬高≥0.2 mV或伴T波抬高，還可出現(xiàn)病理性Q波或原有q波加深；恢復(fù)灌流時(shí)出現(xiàn)T波快速回落、ST段下降50%以上，再灌注時(shí)期還有如房室傳導(dǎo)阻滯、室性心動(dòng)過(guò)速、心室顫動(dòng)等再灌注心律失常發(fā)生。

2.2T-SOD含量和血清CR-MB水平比較與Sham組相比，IR組、Statin組心肌T-SOD含量顯著下降(P<0.01)，Statin組T-SOD含量較IR組升高，但未到Sham組水平(P<0.01)；與Sham組比較，IR組、Statin組血清CK-MB水平顯著升高(P<0.01)，但Statin組血清CK-MB水平低于IR組(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1　3組T-SOD含量及CK-MB水平比較 Table 1　T-SOD,CK-MB comparison among three groups

*P<0.01與Sham組比較#P<0.01與IR組比較(q檢驗(yàn))

2.3心肌梗死面積比較IR組、Statin組AAR/LV 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，即各組心肌缺血危險(xiǎn)程度相似，與IR組相比，Statin組AN/AAR明顯減少(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2　2組心肌梗死面積比較Table 2　Myocardial infarction area comparison between two groups

3討論

目前MIRI的機(jī)制尚未完全明確，主要觀點(diǎn)認(rèn)為能量代謝障礙是其發(fā)生的基礎(chǔ)，在MIRI過(guò)程中自由基、鈣超載、細(xì)胞凋亡、能量代謝障礙、細(xì)胞因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)等起重要作用。他汀類藥物除有效降低膽固醇外，還具有獨(dú)立于降脂作用以外其他有益的作用，具有多途徑心臟保護(hù)作用。他汀的非降脂作用包括改善血管內(nèi)皮功能[4]、抗炎[5]、抗氧化應(yīng)激[6]、抗血小板聚集和抑制血栓形成[7]、抑制心臟電生理重構(gòu)、調(diào)節(jié)心臟自主神經(jīng)功能[8]等。最近研究[9]還發(fā)現(xiàn)他汀類藥物能有效減輕MIRI。MIRI時(shí)氧自由基(oxygen free radical,OFR)的暴發(fā)是其重要的發(fā)病機(jī)制之一[10]。OFR是一類重要的細(xì)胞應(yīng)激原，性質(zhì)極不穩(wěn)定，可造成生物膜結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞核分子變性等不良后果。正常情況下，體內(nèi)過(guò)多的OFR可不斷被抗氧化系統(tǒng)及時(shí)消除，機(jī)體隨時(shí)處于氧化-抗氧化的平衡狀態(tài)中。當(dāng)組織細(xì)胞發(fā)生缺血、缺氧時(shí)，OFR清除功能降低或喪失，生成系統(tǒng)活躍，一旦再次恢復(fù)組織血流和氧的供給時(shí)，OFR便瞬間大量產(chǎn)生，并在體內(nèi)急劇堆積，此時(shí)機(jī)體就處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。OFR通過(guò)攻擊組織內(nèi)皮細(xì)胞膜脂質(zhì)中的不飽和脂肪酸，使膜的結(jié)構(gòu)和功能改變，膜流動(dòng)性降低，通透性增加等；還可使Ca2+通道通透性增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，介導(dǎo)炎性物質(zhì)產(chǎn)生，造成整個(gè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的損傷。OFR增加還直接抑制一氧化氮生成，導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷，觸發(fā)細(xì)胞凋亡[11]。

人體內(nèi)存在完整的抗氧化系統(tǒng)來(lái)保持機(jī)體氧化-抗氧化平衡，其中SOD是最重要的抗氧化酶之一。SOD存在于細(xì)胞線粒體內(nèi)，通過(guò)歧化作用使氧離子進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為水和氧氣，使機(jī)體維持正常生理功能，免受OFR損害。SOD 的活性可間接反映機(jī)體清除自由基和抗氧化損傷的能力[12]。SOD清除OFR的能力是有限的，如果過(guò)氧化物質(zhì)產(chǎn)生過(guò)多，超過(guò)SOD的清除能力，就會(huì)使機(jī)體遭受OFR的氧化損傷[13]。本研究成功建立大鼠IR模型，定量檢測(cè)T-SOD含量，根據(jù)T-SOD可間接反映機(jī)體清除OFR的能力來(lái)評(píng)價(jià)匹伐他汀是否能使OFR清除增多，細(xì)胞受損程度減輕。

本研究結(jié)果顯示,Staitin組較IR組CK-MB水平顯著下降，心肌梗死面積減少，T-SOD下降程度減輕。說(shuō)明Staitin組大鼠較單純IR組機(jī)體的抗氧化能力相對(duì)增強(qiáng)，可提高缺血再灌注后機(jī)體清除OFR的能力，保護(hù)心功能。表明匹伐他汀可明顯提高機(jī)體的抗氧化能力，且降低了心肌受損程度，提示其抗氧化應(yīng)激作用是減輕MIRI機(jī)制之一。

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(本文編輯：趙麗潔)

[收稿日期]2014-05-26；[修回日期]2014-06-24

[基金項(xiàng)目]河北省科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(112761155)

[作者簡(jiǎn)介]尤楊(1980-)，女，河北無(wú)極人，河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事心血管疾病診治研究。

*通訊作者

[中圖分類號(hào)]R542.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1007-3205(2015)04-0373-04

[摘要]目的探討匹伐他汀對(duì)大鼠急性心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)的保護(hù)作用，為他汀類藥物在缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)心肌的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。方法將成年雄性SD大鼠42只隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、IR組及實(shí)驗(yàn)組(Statin組)各14只。Sham組與IR組術(shù)前給予生理鹽水2 mL/d灌胃4周，Statin組給予匹伐他汀0.42 mg·kg-1·d-1，溶解成2 mL灌胃4周。制作大鼠心肌IR模型：Sham組冠狀動(dòng)脈下只穿線，不結(jié)扎；IR組、Statin組結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支30 min，再松解120 min。術(shù)后檢測(cè)血清中肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme-MB,CK-MB)水平，留取結(jié)扎線下部分心肌組織用黃嘌呤氧化酶法測(cè)心肌總超氧化物岐化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)活性，用氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride,TTC)、伊文思藍(lán)雙染色法測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組心肌梗死面積及缺血區(qū)面積。結(jié)果與Sham組相比，IR組、Statin組的血清CK-MB升高，T-SOD含量下降(P<0.01)；Statin組CK-MB升高程度不及IR組(P<0.01)，T-SOD含量下降程度不及IR組(P<0.01)。IR組和Statin組危險(xiǎn)區(qū)面積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與IR組相比，Statin組梗死面積明顯減小(P<0.01)。結(jié)論匹伐他汀可以提高機(jī)體抗氧化能力，減輕再灌注后心肌壞死程度，減輕MIRI。

Effects of pitavastatin on role of oxidative stress in a rat model of myocardial ischemia-reperfusion

YOU Yang1,FENG Qian2,XIA Yue1*,QI Guo-qing1,ZHANG Yan1，ZHANG Qing-wen1

(1.Department of Cardiovascular Medicine Ⅲ,the First Hospital of Hebei Medical University,

Shijiazhuang 050031,China；2.Department of Cardiovascular Medicine Ⅲ, the First Hospital of

Zhangjiakou City,Hebei Province，Zhangjiakou 075000, China)

[Abstract]ObjectiveTo explore the effects of pitavastain on the role of oxidative stress in a rat model of myocardial ischemia-reperfusion,which will provide a theoretical basis for pitavastain clinical application in myocardial ischemia-reperfusion.MethodsA total of 42 male SD rats were randomly assigned to three groups:Sham group, control group(IR group) and experimental group(Statin group).In Sham group and control group,2 mL saline was irrigated into stomach daily for four weeks, 0.42 mg/kg pitavastain dissolved in 2 mL saline was given in experimental group. In surgery, we wore line under the coronary artery without ligation in Sham group, and ligated the line for 30 minutes and then released it for 2 hours in IR group and Statin group.The levels of CK-MB were discerned after operation. Some myocardium tissue specimens under the line for ligation were used to detect the activity of total superoxide dismutase(T-SOD).The myocardial infarction size and risk area of each group were analyzed through comparing the differentiation of myocardium tissue stained by triphenyl tetrazolium chloride(TTC) and Evans blue by computer software system.ResultsThe levels of CK-MB elevated and T-SOD content decreased significantly in control group and experimental group as compared with Sham group(P<0.01).In IR group,the level of CK-MB was significantly higher than that of statin group,but lower when comes to T-SOD content(P<0.01).There were no statistical significance between statin group and IR group compared with area at risk(P>0.05). Statin group significantly reduced infarct size compared with IR group(P<0.01) .ConclusionPitavastatin could increase antioxidant capacity and it took a positive role in ischemia-reperfusion myocardial injury prevention.

[Key words]myocardial reperfusion injury；pitavastain；oxidative stress