重組人紅細胞生成素對高糖誘導人腎小管上皮細胞增殖及凋亡的影響及其可能機制

陳艷霞，吳險峰，房向東，秦曉華，黃翀，涂衛(wèi)平

重組人紅細胞生成素對高糖誘導人腎小管上皮細胞增殖及凋亡的影響及其可能機制

陳艷霞，吳險峰，房向東△，秦曉華，黃翀，涂衛(wèi)平

目的探討重組人紅細胞生成素（rhEPO）對高糖誘導的正常人腎小管上皮（HK-2）細胞增殖及凋亡的影響及其可能機制。方法將體外培養(yǎng)的HK-2細胞按隨機數(shù)字表法分為空白對照組、高糖誘導組（高糖終濃度為30 mmol/L）、甘露醇對照組（甘露醇濃度為24.5 mmol/L）、rhEPO對照組（rhEPO終濃度為20 U/mL）、不同濃度rhEPO干預組（高糖終濃度為30 mmol/L+rhEPO終濃度分別為5、10、20 U/mL）及Rho激酶抑制劑（Y27632）組（Y27632終濃度為30 μmol/L+高糖終濃度為30 mmol/L），各組均刺激24 h。應用RT-PCR法檢測各組HK-2細胞RhoA、ROCK1 mRNA的表達；MTT法測定細胞增殖，流式細胞技術分析細胞凋亡。結(jié)果高糖誘導組RhoA及ROCK1 mRNA表達較空白對照組顯著升高（P＜0.05），不同濃度rhEPO干預組RhoA mRNA及ROCK1 mRNA的表達較高糖誘導組顯著減少（P＜0.05），高糖誘導組及不同濃度rhEPO干預組RhoA mRNA與ROCK1 mRNA表達呈正相關。rhEPO可明顯促進HK-2細胞增殖（P＜0.05），而高糖可誘導正常人腎小管上皮細胞凋亡，加入不同濃度rhEPO或Y27632干預后，其凋亡明顯受抑制（P＜0.05），且在實驗rhEPO濃度范圍內(nèi)，rhEPO促進增殖及抑制凋亡的作用呈現(xiàn)濃度依賴性。結(jié)論rhEPO可促進高糖誘導的HK-2細胞增殖，抑制高糖誘導的HK-2細胞凋亡，其機制可能與阻斷RhoA/ROCK信號通路有關。

紅細胞生成素,重組；細胞增殖；細胞凋亡；rho相關激酶類；HK-2細胞；高糖；RhoA/ROCK信號通路

糖尿病腎?。―N）是糖尿病全身微血管病變的一部分，是糖尿病的嚴重慢性并發(fā)癥，已成為終末期腎病的重要原因。DN是多因素多基因共同作用的結(jié)果。高血糖是引起DN的始動因素，控制血糖藥物可以幫助調(diào)節(jié)血糖水平從而保護腎功能，進而延緩腎衰竭進展，但不能完全阻止DN的進展。紅細胞生成素（EPO）是一種分子質(zhì)量為304 ku的糖蛋白激素，主要作用于骨髓紅系祖細胞，抑制其凋亡，促進紅細胞的生成，以維持組織氧供的需要。1985年首次應用EPO以來，EPO在臨床上的應用始終局限于糾正各種貧血。近年來，逐漸發(fā)現(xiàn)EPO可能不僅僅有促進紅細胞生成的作用[1]。有學者對EPO抗凋亡減輕腎間質(zhì)纖維化方面的作用進行了研究，Wang等[2]檢測EPO對馬兜鈴酸所誘導人腎小管上皮（HK-2）細胞凋亡指標，證實EPO可通過促進抗凋亡蛋白的表達、抑制凋亡蛋白酶的高表達，從而抑制HK-2細胞凋亡。本實驗采用高糖誘導HK-2細胞模擬DN時HK-2細胞所處的高糖環(huán)境，探討重組人紅細胞生成素（rhEPO）對高糖誘導的HK-2細胞增殖及凋亡的作用及其可能機制，為延緩DN腎纖維化進展尋找新的干預靶點。

1 材料與方法

1.1 主要試劑HK-2細胞株來源于美國ATCC細胞庫，rhEPO（沈陽三生），DMEM/F12培養(yǎng)基（美國Hyclone），高糖、甘露醇、Rho激酶抑制劑、Y27632（美國Sigma），RNA抽提試劑Trizol（美國Invitrogen），RT-PCR試劑盒（北京全式金），2×EasyTaq PCR SuperMix（北京全式金），聚合酶鏈反應引物由Invitrogen公司合成，MTT溶液（南京森貝伽生物科技有限公司）。

1.2 主要儀器核酸微量蛋白測定儀、PCR擴增儀、凝膠圖像成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad），DYPC-31DN型電泳儀（北京市六一儀器廠），流式細胞儀（美國Beckman），酶標儀（美國Thermo公司）。

1.3 HK-2細胞培養(yǎng)及實驗分組用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HK-2細胞，正常HK-2為橢圓形或梭形，呈“鵝卵石”或“鋪路石”樣排列。將體外培養(yǎng)的HK-2細胞按隨機數(shù)字表法分為空白對照組、高糖誘導組（高糖終濃度為30 mmol/L）、甘露醇對照組（甘露醇濃度為24.5 mmol/L）、rhEPO對照組（rhEPO終濃度為20 U/mL）、不同濃度rhEPO干預組（高糖終濃度為30 mmol/L+rhEPO終濃度分別為5、10、20 U/mL）及Rho激酶抑制劑（Y27632）組（Y27632終濃度為30 μmol/L+高糖終濃度為30 mmol/L），以上各組均培養(yǎng)24 h。實驗重復3次。

1.4 RT-PCR檢測用Trizol分別提取各組細胞總的RNA，檢測RNA完整性后用核酸微量蛋白測定儀測定RNA的濃度。取總RNA 1.5 μg進行逆轉(zhuǎn)錄反應合成cDNA，取2 μL cDNA在2×EasyTaq PCR SuperMix的作用下擴增目標基因（以人β-actin為內(nèi)參照），總反應體系50 μL。RhoA引物序列：正義鏈5′-GGCTGGACTCGGATTCGTTG-3′,反義鏈5′-CGTTGGGACA GAAATGCTT GAC-3′,擴增產(chǎn)物356 bp。ROCK1引物序列：正義鏈5′-TGATGGCTATTATGGACGAG-3′，反義鏈5′-GGAGCGTTTCCCAAGC-3′,擴增產(chǎn)物293bp。β-actin引物序列：正義鏈5′-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，反義鏈5′-TGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′，擴增產(chǎn)物434 bp。凝膠成像系統(tǒng)成像并使用Quantity One軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.5 MTT法檢測細胞增殖收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，鋪板使HK-2細胞調(diào)密度1 000～10 000/孔（96孔板）。放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞單層鋪滿孔底，每組設5個復孔。培養(yǎng)24、48、72 h后離心棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗3遍，各孔加入20 μL MTT溶液（5 g/L），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加150 μL二甲基亞砜（DMSO），置搖床上低速振蕩10 mim，使孔內(nèi)的結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測儀測量490 nm處各孔的OD值。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡按實驗分組分別培養(yǎng)各組細胞24 h后，用不含EDTA的胰酶消化收集各組細胞。用PBS洗滌細胞2次（2 000 r/min離心5 min）收集（1～5）×105細胞。加入500 μL的Binding Buffer懸浮細胞。加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL Propidium Iodide，混勻。室溫、避光、反應5～15 min。在1 h內(nèi)，流式細胞儀上檢測細胞凋亡。

1.7 統(tǒng)計學方法應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料用均數(shù)±標準差表示，多組均數(shù)比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t法。變量間的相關性采用Pearson直線相關分析。檢驗水準為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 高糖、rhEPO對RhoA、ROCK1 mRNA表達的影響高糖誘導組RhoA及ROCK1 mRNA表達較空白對照組明顯升高（P＜0.05），不同濃度rhEPO干預組RhoA及ROCK1 mRNA的表達較高糖誘導組顯著減少（P＜0.05），且在實驗rhEPO濃度范圍內(nèi)，呈現(xiàn)出rhEPO濃度的依賴性，見圖1、表1。

2.2 rhEPO、Y27632對HK-2細胞增殖的影響不同濃度rhEPO作用24、48、72 h后，隨著rhEPO濃度的增加及時間的延長，HK-2細胞的增殖越來越明顯，與對照組相比，rhEPO對照組及不同濃度rhEPO干預組均有明顯促進增殖的作用，不同rhEPO濃度均以72 h促進增殖作用最明顯，表明rhEPO能時間、劑量依賴性地促進HK-2細胞增殖?？瞻讓φ战M與甘露醇對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，Rho激酶抑制劑組較高糖誘導組增殖明顯，差異有統(tǒng)計學意義，見表2。

Fig.1The expression of RhoA mRNA and ROCK1 mRNA in eight groups of cells圖1 各組細胞RhoA mRNA及ROCK1 mRNA的表達情況

Tab.1The expression levels of RhoA mRNA and ROCK1 mRNA in eight groups of cells表1 各組細胞RhoA mRNA及ROCK1 mRNA的表達相對水平（n=3）

Tab.1The expression levels of RhoA mRNA and ROCK1 mRNA in eight groups of cells表1 各組細胞RhoA mRNA及ROCK1 mRNA的表達相對水平（n=3）

＊＊P＜0.01；a與空白對照組比，b與高糖誘導組比，c與5 U/mL rhEPO干預組比，d與10 U/mL rhEPO干預組比，P＜0.05；表2、3同

組別空白對照組高糖誘導組甘露醇對照組rhEPO對照組5 U/mL rhEPO干預組10 U/mL rhEPO干預組20 U/mL rhEPO干預組Rho激酶抑制劑組F RhoA 0.944 6±0.131 5 1.400 3±0.021 7a 0.951 9±0.003 8 0.944 5±0.010 7 1.277 9±0.005 5ab 0.770 3±0.004 5abc 0.333 7±0.009 3abcd 1.390 4±0.001 9acd 6 829.397＊＊ROCK1 1.007 4±0.002 0 1.913 0±0.010 9a 1.003 3±0.001 9 1.004 4±0.002 2 1.417 6±0.005 5ab 0.918 6±0.003 5abc 0.476 6±0.002 2abcd 0.248 9±0.004 6abcd 31 724.282＊＊

Tab.2Effects of different concentrations of rhEPO on HK-2 cell proliferation表2 不同濃度的rhEPO對HK-2細胞增殖的影響（n=5,OD值

Tab.2Effects of different concentrations of rhEPO on HK-2 cell proliferation表2 不同濃度的rhEPO對HK-2細胞增殖的影響（n=5,OD值

組別空白對照組高糖誘導組甘露醇對照組rhEPO對照組5 U/mL rhEPO干預組10 U/mL rhEPO干預組20 U/mL rhEPO干預組Rho激酶抑制劑組F 24 h 1.276±0.006 0.928±0.010a 1.268±0.011 1.749±0.038a 1.586±0.012ab 1.645±0.013abcd 1.728±0.010abcd 1.463±0.007ab 871.947＊＊48 h 1.291±0.010 0.964±0.014a 1.297±0.017 1.908±0.014a 1.744±0.012ab 1.796±0.009abcd 1.851±0.006abcd 1.658±0.010ab 2 338.355＊＊72 h 1.304±0.010 0.972±0.005a 1.296±0.008 1.934±0.006a 1.788±0.008ab 1.824±0.006abcd 1.882±0.006abcd 1.689±0.009ab 6 809.568＊＊

2.3 高糖、rhEPO、Y27632對HK-2細胞凋亡的影響HK-2細胞按實驗分組給予相應刺激24 h后，高糖可誘導HK-2細胞的凋亡，其早期凋亡率及晚期凋亡加死亡細胞比率均較空白對照組明顯升高（P＜0.05），給予rhEPO及Y27632干預后，其早期凋亡率及晚期凋亡加死亡細胞比率均較高糖誘導組明顯降低（P＜0.05），且呈現(xiàn)出rhEPO劑量的依賴性，見表3、圖2。

Tab.3The apoptotic rates in eight groups of cells表3 各組細胞凋亡率(n=3,%)

Tab.3The apoptotic rates in eight groups of cells表3 各組細胞凋亡率(n=3,%)

組別空白對照組高糖誘導組甘露醇對照組rhEPO對照組5 U/mL rhEPO干預組10 U/mL rhEPO干預組20 U/mL rhEPO干預組Rho激酶抑制劑組F早期凋亡率0.031±0.005 5.847±0.153a0.033±0.004 0.031±0.006 3.937±0.059abd2.830±0.044abc1.067±0.090abcd0.982±0.015ab3 009.759＊＊晚期凋亡和死亡細胞比率0.953±0.325 3.787±0.506a1.033±0.486 0.991±0.219 3.187±0.064abd2.600±0.271abc1.718±0.086abcd1.723±0.014ab38.291＊＊

2.4 相關性分析高糖誘導組，5、10、20 U/mL rhEPO干預組RhoA mRNA與ROCK1 mRNA均呈正相關（r分別為0.885、0.901、0.886、0.868，均P＜0.05）。

3 討論

腎臟肥大是DN早期的病理改變之一。血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）可引起系膜細胞、纖維細胞、遠端HK-2細胞增生，近端HK-2細胞肥大。HK-2細胞的增殖與凋亡保持動態(tài)平衡狀態(tài)在腎臟的生長、發(fā)育及自身穩(wěn)定狀態(tài)的維持中具有非常重要的作用。高糖對體外培養(yǎng)HK-2細胞的增殖起到一定的抑制作用[3]。DN患者腎小管上皮細胞凋亡與壞死明顯增加，抑制其凋亡一方面可以延緩DN的進展，另一方面，對促進HK-2細胞增殖也可發(fā)揮重要作用。EPO在一定濃度和時間內(nèi)能刺激高糖培養(yǎng)的小鼠系膜細胞增殖[4]。EPO能促進體外培養(yǎng)的新生豬胰島細胞的增殖分化，而對其形態(tài)和功能無影響[5]。不同濃度EPO對體外培養(yǎng)神經(jīng)干細胞均具有促進增殖的作用，尤其以EPO濃度為50 U/mL作用明顯[6]。本研究顯示，不同濃度rhEPO作用高糖誘導下的HK-2細胞24、48、72 h后，隨著rhEPO濃度的增加及時間的延長，HK-2細胞的增殖越來越明顯，與空白對照組相比，rhEPO對照組及不同濃度rhEPO干預組均有明顯促進增殖的作用，且差異均具有統(tǒng)計學意義，不同rhEPO濃度均以72 h促進增殖作用最明顯，表明rhEPO能時間、劑量依賴性地促進HK-2細胞增殖?？瞻讓φ战M與甘露醇對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，Rho激酶抑制劑組較高糖誘導組增殖明顯，差異有統(tǒng)計學意義。本研究也表明，給予不同濃度rhEPO干預高糖誘導的HK-2細胞轉(zhuǎn)分化過程中，RhoA mRNA的表達與ROCK1 mRNA的表達呈正相關，推測不同濃度rhEPO促進HK-2細胞增殖可能與作用Rho/ROCK信號通路有關。雖然rhEPO促進HK-2細胞增殖具有濃度依賴性，但并不意味著濃度越高其作用越明顯，王蕾等[4]發(fā)現(xiàn)EPO濃度為1 000 U/mL時具有明顯的細胞毒性，大部分細胞出現(xiàn)死亡。EPO促進HK-2細胞增殖的時間依賴性是否與RhoA/ROCK信號通路有關尚需進一步研究。

Fig.2Results of apoptosis detected by flow cytometry in eitht groups圖2 各組細胞流式細胞檢測凋亡圖

RhoA/ROCK信號通路與細胞骨架的穩(wěn)定與改變有關[7]。李峰[8]發(fā)現(xiàn)在白血病細胞中，RhoA/ROCK信號通路參與細胞凋亡的過程。高糖可以誘導HK-2細胞凋亡，并且與HK-2細胞損傷及蛋白尿的發(fā)生密切相關，與DN的進展及腎功能損害也存在著緊密的聯(lián)系[9]。EPO可通過紅細胞生成素受體（EPOR）的介導，緩解高糖誘導的氧化應激，上調(diào)bcl-2 mRNA表達，下調(diào)bax、caspase-3 mRNA表達，抑制HK-2細胞凋亡[10]。EPO可通過促進抗凋亡蛋白bcl-xl的表達、抑制凋亡蛋白酶caspase-3的過高表達，從而抑制了馬兜鈴誘導的HK-2細胞的凋亡[11]。ROCK1是caspase-3的底物，在組織發(fā)育或細胞凋亡過程中，caspase-3活化后能夠切割ROCK1蛋白質(zhì)的羧基端，使ROCK1變成活化的形式，進而通過調(diào)控細胞骨架來參與調(diào)亡時發(fā)生的細胞形態(tài)改變。另外，最近有研究發(fā)現(xiàn)EPO可以降低高糖誘導的大鼠腎小管細胞內(nèi)的氧化應激水平，抑制腎小管細胞凋亡[10]。EPO可以減輕順鉑引起的腎損害，其機制可能與調(diào)節(jié)未折疊蛋白反應減輕HK-2細胞凋亡相關[12]。ROCK1的活性主要與RhoA活化有關。ROCK1常常以無活性的形式存在于細胞中，當活性RhoA結(jié)合在ROCK1的Rho結(jié)合區(qū)后，ROCK1通過其羧基端的變構(gòu)轉(zhuǎn)為活性狀態(tài)。本研究表明，高糖可誘導HK-2細胞的凋亡，其早期凋亡率及晚期凋亡加死亡細胞比率均較空白對照組明顯升高，給予rhEPO及Y27632干預后，其早期凋亡率及晚期凋亡加死亡細胞比率均較高糖誘導組明顯較少，且呈現(xiàn)出rhEPO劑量的依賴性。因此，推測rhEPO可能通過調(diào)控RhoA/ROCK信號通路而參與高糖誘導HK-2細胞凋亡的過程。

目前EPO在臨床的應用還是其經(jīng)典的作用，即改善貧血。雖然大量體內(nèi)外研究已證實EPO具有心臟、腎臟、神經(jīng)等保護作用，還具有抗炎、抗凋亡及促進增殖的作用，理論上可從不同方面干預DN的進展，延緩DN向終末期腎臟病進展的速度。然而還缺乏長期、大量的臨床研究證實，并且EPO在發(fā)揮臟器保護作用的同時，其潛在毒性作用如高血壓、血栓、充血性心力衰竭等也限制了其在臨床的使用，有待于進一步深入研究。

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（2014-07-08收稿2014-09-09修回）

（本文編輯李國琪）

Effects of erythropoietin in high glucose induced proliferation and apoptosis of human kidney proximal tubular epithelial cells and the possible mechanism

CHEN Yanxia,WU Xianfeng,FANG Xiangdong△,QIN Xiaohua,HUANG Chong,TU Weiping
Department of Nephrology,the Second Affiliated Hospital of Medical College of Nanchang University, Nanchang 330006,China△

ObjectiveTo study the effects of erythropoietin(rhEPO)in high glucose induced proliferation and apoptosis of human kidney proximal tubular epithelial(HK-2)cells,and the possible mechanism thereof.MethodsHK-2 cells cultured in vitro were divided into several groups randomly:blank control group,high glucose group,mannitol group,rhEPO control group,different concentrations of rhEPO treatment groups(5,10,20 U/mL)and Rho kinase group.The reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)was used to evaluate the mRNA levels of RhoA and ROCK after 24 hours. Tetrazolium salt method(MTT)was used to determine the cell proliferation.Cell apoptosis was detected by flow cytometry. ResultsCompared with blank control group the expression levels of RhoA and ROCK1 mRNA were significantly increased in high glucose group(P＜0.05).RhoA,ROCK1 mRNA expressions significantly decreased in rhEPO group than those of high glucose group(P＜0.05).There was a positive correlation between the expression levels of RhoA mRNA and ROCK1 mRNA in high glucose group and rhEPO group.MTT method showed that rhEPO significantly promoted the proliferation of HK-2 cells(P＜0.05).Flow cytometry analysis showed that high glucose induced apoptosis in HK-2 cells,which was significantly inhibited in rhEPO group and Rho kinase group as compared to that of high glucose group in a concentration dependent manner(P＜0.05).ConclusionrhEPO can promote HK-2 cell proliferation and inhibit apoptosis,which may be related to RhoA/ROCK signaling pathway.

erythropoietin,recombinant;cell proliferation;apoptosis;rho-associated kinases;HK-2 cells;high glucose;RhoA/ROCK signaling pathway

R692

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2015.01.007

江西省自然科學基金（20122BAB205006）

江西省南昌大學第二附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科（郵編330006）

陳艷霞（1988），女，碩士，主要從事腎臟風濕免疫研究

△通訊作者E-mail：xiangdongdang818@sina.com