羅格列酮對膿毒癥大鼠血糖及肺部炎癥反應(yīng)的影響

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(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科，湖南 衡陽 421001)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

羅格列酮對膿毒癥大鼠血糖及肺部炎癥反應(yīng)的影響

周靈芝*，張熠,康婷,高順利

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科，湖南 衡陽 421001)

目的探索羅格列酮對膿毒癥大鼠血糖及肺部炎癥反應(yīng)的影響。方法采用結(jié)腸結(jié)扎穿孔法建立膿毒癥大鼠模型，36只SD大鼠隨機(jī)分為3組，分別為膿毒癥組、羅格列酮處理組和假手術(shù)組，每組12只。分別于造模后12 h，24 h行血漿血糖檢測；HE染色及髓過氧化物酶(MPO)活性檢測觀察肺組織中性粒細(xì)胞聚集情況；熒光定量PCR檢測肺組織炎癥因子IL-6、TNF-α的表達(dá)變化。每時間點檢測大鼠6只。結(jié)果與假手術(shù)組比較,膿毒癥組組大鼠肺部炎癥因子IL-6、TNF-α表達(dá)增高。肺組織微血管通透性增加,肺泡壁增厚,間質(zhì)水腫,白細(xì)胞浸潤,MPO活性明顯增強(P<0.05)；與膿毒癥組比較,羅格列酮處理組肺間質(zhì)水腫程度減輕,白細(xì)胞浸潤減少,炎癥因子的表達(dá)受到抑制(P<0.05)。三組大鼠各時間點血糖差別不明顯(P>0.05)。結(jié)論羅格列酮能夠降低膿毒癥大鼠肺組織炎癥因子IL-6、TNF-α的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)。但對大鼠血糖無明顯影響。

羅格列酮； 膿毒癥； 肺； 炎癥反應(yīng)

膿毒癥是由感染導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)綜合征(system in flammatory response syndrome,SIRS),是嚴(yán)重創(chuàng)傷、休克、外科大手術(shù)后常見的并發(fā)癥。膿毒癥時，由于炎癥介質(zhì)的“瀑布樣釋放”可導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征(multi organ dysfunction syndrome,MODS)，其中肺臟是最易受累的器官。研究發(fā)現(xiàn)過氧化物酶體增殖物激活受體γ激動劑羅格列酮(Rosiglitazone ROSI)可通過抑制炎癥介質(zhì)的表達(dá)而減輕炎癥反應(yīng),ROSI在膿毒癥及缺血再灌注損傷發(fā)生過程中都發(fā)揮著抗炎作用。本文就ROSI對結(jié)腸結(jié)扎穿孔模型大鼠血糖及肺部炎癥反應(yīng)的干預(yù)作用進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1動物分組與處理SD大鼠36只,體重250～300 g,雌雄不拘，由南華大學(xué)實驗動物部提供。實驗前及實驗過程中自由攝食、飲水。動物隨機(jī)分為3組，膿毒癥組、羅格列酮處理組(ROSI 0.3 mg/kg)和假手術(shù)組。每組12只。膿毒癥組:行盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)。假手術(shù)組:開腹，暴露盲腸，不行盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)。羅格列酮處理組:手術(shù)同膿毒癥組，術(shù)后立即尾靜脈注射稀釋后(0.3 mg/mL)的羅格列酮,以后每12 h一次。A,C組均按體重計算注射等量生理鹽水。造模后12 h、24 h氯胺酮麻醉處死大鼠留取標(biāo)本。各組大鼠均監(jiān)測體溫、呼吸頻率、血壓、心率及攝食狀況。

1.2主要試劑與儀器羅格列酮購自美國Cayman公司；髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)比色活性檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；HE染色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；熒光定量PCR檢測試劑盒購自北京天根公司；Trizol購自invitrogen公司；引物合成由上海生物工程有限公司完成(IL-6:上游引物5-AGCCCACCAGGAACGAAAGTC-3下游引物,5-TGGAAGTTGGGGTAGG AAGGA-3,片段大小559bp；TNF-α:上游引物5-TGCCTCAGCCTCTT CTCATT-3 下游引物5-GCTTGGTGGTTTGCTACGAC-3，片段大小209bp;GAPDH:上游引物5-GTCAGTGGTGGACCT GACCT-3 下游引物5-AGGGGTCT ACATGGCAACTG-3，片段大小420 bp)。

1.3檢測指標(biāo)及方法

1.3.1 血常規(guī)及血糖檢測 大鼠頸動脈采血后立即采用上海ABX全自動血細(xì)胞分析儀檢測血常規(guī)，日本東芝全自動生化儀檢測全血葡萄糖濃度。

1.3.2 肺組織形態(tài)學(xué)觀察 右肺中葉用10%甲醛固定,常規(guī)石蠟切片。進(jìn)行蘇木精—伊紅(HE)染色,普通光鏡下觀察肺組織的肺泡充血、水腫及炎癥細(xì)胞浸潤情況。

1.3.3 MPO活性測定 準(zhǔn)確稱取肺組織重量100 mg/例,剪碎組織塊,與配制好的勻漿介質(zhì)按重量體積比1:19勻漿(10000r/min、勻漿液1 mL),制備成5%的組織勻漿。檢測按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.4 炎癥因子檢測 大鼠處死后，立即取新鮮左下肺新鮮標(biāo)本以預(yù)冷的PBS沖洗干凈后立即液氮研磨，Trizol法提取總RNA，按cDNA第一鏈合成試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄，北京天根公司染色法熒光定量PCR試劑盒行PCR檢測。

2 結(jié) 果

2.1膿毒癥大鼠模型的建立參照Remick DG等關(guān)于盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)膿毒癥大鼠模型的手術(shù)方式及診斷標(biāo)準(zhǔn)，膿毒癥組及羅格列酮處理組大鼠術(shù)后12 h均出現(xiàn)攝食減少、發(fā)熱癥狀，肛溫平均增加1.5 ℃；呼吸頻率較術(shù)前增加1倍；心率較術(shù)前增加50%；白細(xì)胞增升高1倍以上，符合膿毒癥大鼠診斷標(biāo)準(zhǔn)。假手術(shù)組大鼠術(shù)后12 h攝食基本正常，體溫、心率、呼吸變化不明顯。白細(xì)胞稍有上升，但較術(shù)前增加不到1倍。

2.2血糖的檢測如表1所示，三組大鼠各時間點血糖水平無明顯差異(P>0.05)。

表1各組大鼠血漿葡萄糖濃度檢測(mmol/L)

組別0h12h24h膿毒癥組4.45±0.895.38±1.086.12±1.12ROSI組4.36±0.714.31±0.915.78±0.95假手術(shù)5.46±0.955.53±1.124.50±0.89

2.3肺組織形態(tài)學(xué)改變?nèi)鐖D1所示，假手術(shù)組小鼠肺組織小葉結(jié)構(gòu)清晰,肺泡腔干凈,肺泡間質(zhì)少量炎性細(xì)胞浸潤,肺泡壁無增厚,支氣管黏膜上皮完整。膿毒癥組肺組織充血明顯,肺泡間質(zhì)有大量炎性浸潤,肺泡壁增寬,肺泡腔內(nèi)可見炎性滲出,肺組織病理改變12～24 h逐漸加重。ROSI處理后肺組織充血程度、肺泡間質(zhì)炎性浸潤和滲出較膿毒癥組明顯改善,肺泡壁無明顯水腫。

圖1 各組大鼠肺部組織病理變化(HE，100×) A：膿毒癥組；B:羅格列酮處理組；C：假手術(shù)組

2.4肺組織MPO活性的變化結(jié)果表明,與假手術(shù)組比較,膿毒癥組術(shù)后12,24 h,小鼠肺部MPO活性均顯著增強,ROSI干預(yù)后,MPO活性明顯降低。結(jié)果見圖2。

圖2 ROSI對膿毒癥大鼠肺組織MPO的干預(yù)作用 與膿毒癥組比較，*：P<0.05，**：P<0.01

2.5炎癥因子的變化建模后12 h，24 h各組大鼠肺部炎癥因子水平如圖3、4所示。膿毒癥組IL-6、TNF-αmRNA水平在12 h、24 h逐漸增高。ROSI處理組在12 h、24 h IL-6、TNF-αmRNA水平有增高，但高峰水平低于同期膿毒癥組(P<0.05)。假手術(shù)組炎癥因子各時間點變化不明顯且低于同期其他兩組(P<0.05)。

3 討 論

羅格列酮通過與過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptors gamma,PPARγ)結(jié)合，使PPARγ/RXRα發(fā)生空間構(gòu)象改變，與輔抑制因子脫離并結(jié)合輔激活因子，進(jìn)而與靶基因啟動子上的PPAE結(jié)合，激活靶基因轉(zhuǎn)錄而激活細(xì)胞內(nèi)信號通路發(fā)揮其作用。PPARγ活化可以調(diào)控NF-κB和AP-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在轉(zhuǎn)錄水平抑制IL-6、TNF-α的表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用。研究表明羅格列酮與吡格列酮可以抑制支氣管哮喘、動脈硬化、炎癥性腸病等器官的慢性炎癥反應(yīng)，減輕病變部位中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的浸潤與炎癥因子的表達(dá)。二者能夠減輕膿毒癥大鼠的全身炎癥反應(yīng)，而對于膿毒癥最易損傷的肺臟，羅格列酮對肺部炎癥細(xì)胞浸潤、炎癥因子表達(dá)及其對大鼠血糖的影響目前尚無報道。

圖3 ROSI對膿毒癥大鼠肺組織IL-6 mRNA表達(dá)的影響與假手術(shù)組比較，**：P<0.01。與膿毒癥組及假手術(shù)組比較，*：P<0.05

圖4 ROSI對膿毒癥大鼠肺組織TNF-α mRNA表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較，**：P<0.01；與膿毒癥組組比較，*：P<0.05

本研究通過采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)構(gòu)建膿毒癥大鼠模型，通過羅格列酮尾靜脈注射的方法，研究發(fā)現(xiàn)，盲腸結(jié)扎穿孔后12小時大鼠出現(xiàn)明顯全身炎癥反應(yīng)表現(xiàn)，達(dá)到膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)，此時大鼠肺組織已經(jīng)受累，表現(xiàn)為組織MPO活性明顯增高，肺泡間質(zhì)充血及炎性細(xì)胞浸潤,肺泡壁增寬,肺泡腔內(nèi)可見炎性滲出。而羅格列酮治療能降低組織MPO活性，減輕肺組織充血程度，減少肺泡間質(zhì)炎性浸潤,減輕肺泡壁水腫。各組大鼠肺部炎癥因子檢測也表明，膿毒癥組大鼠12～48小時肺部炎癥因子TNF-α、IL-6水平逐漸增高。而予以羅格列酮治療后，TNF-α、IL-6水平有明顯減低。這一實驗結(jié)果提示，羅格列酮在盲腸結(jié)扎穿孔導(dǎo)致的膿毒癥大鼠肺損傷中具有明確的抑制炎癥介質(zhì)釋放，減輕炎癥反應(yīng)的作用。

為了明確羅格列酮在減輕膿毒癥炎癥反應(yīng)的同時對血糖的影響情況，本實驗同時檢測了各組大鼠的血糖，研究發(fā)現(xiàn)，三組大鼠各時間點血糖無明顯差異，未因羅格列酮降糖作用而出現(xiàn)低血糖。我們分析其原因可能是膿毒癥組大鼠炎癥因子水平增加最高，全身炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的應(yīng)激最為強烈，此時大鼠攝食基本停止，機(jī)體血糖水平依靠應(yīng)激性升高維持在正常。ROSI組大鼠炎癥反應(yīng)相對較輕，可以適當(dāng)攝食，羅格列酮對血糖降低的影響通過大鼠攝食及炎癥應(yīng)激所導(dǎo)致的升高得到調(diào)控，因此血糖也維持在正常范圍。假手術(shù)組大鼠基本無明顯炎癥反應(yīng)，攝食正常，血糖穩(wěn)定在正常水平。當(dāng)然，其確切的血糖調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步實驗研究闡明。

綜上所述，本研究表明，羅格列酮能夠降低膿毒癥大鼠肺組織炎癥因子IL-6、TNF-αmRNA的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)。但對大鼠血糖無明顯影響且不會導(dǎo)致低血糖發(fā)生。本研究可能為羅格列酮的臨床應(yīng)用及膿毒癥的藥物治療提供新的思路。

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EffectofRosiglitazoneontheBloodGlucoseandPulmonaryInflammationinSepticRats

ZHOU Lingzhi,ZHANG Yi,KANG Ting,et al

(DepartmentofPediatrics,theFirstAffiliatedHospital，UniversityofSouthChina，Hengyang421001,Hunan,China)

ObjectiveTo explore the effect of rosiglitazone on the control of blood glucose and pulmonary inflammation in septic rats.MethodsThe model of septic rat was established by ligation and puncture on the colon.36 SD rats were randomly divided into three groups,they were sepsis group,sepsis with rosiglitazone intervention group (ROSI 0.3 mg/kg) and sham-operated group,12 rats in each group.Blood glucose was tested 12 and 24 hours after intervention.IL-6，TNF-α expression level in lung tissue were detected by quantitative PCR.Neutrophil aggregation status was observed by HE staining and myeloperoxidase (MPO) activity detection.6 rats were executed in each time.ResultsCompared with sham-operated group,TNF-α and IL-6 mRNA expression level in sepsis group were obviously increased.The permeability of lung microvascular,thickness of alveolar wall,edema of interstitial and activity of MPO were significantly enhanced in sepsis group (P<0.05);Compared with sepsis group,the inflammatory cytokines expression level and the degree of lung inflammation in rosiglitazone intervention group were significantly reduced (P<0.05).There were no differences in blood glucose level between three groups.(P>0.05).ConclusionRosiglitazone can inhibit the expression of TNF-α and IL-6 and reduce inflammation response in septic lung tissue without influence on blood glucose.It has certain effect on septic lung injure.

rosiglitazone; sepsis; lung; inflammation

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.04.008

2014-06-22；

2015-03-013

*通訊作者，E-mail：lingzhi.zhou@163.com.

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(此文編輯：秦旭平)