阿托伐他汀對血脂異常兔血清和脂肪組織脂聯(lián)素的影響

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(1.南華大學(xué)第一臨床學(xué)院心血管內(nèi)科，湖南 衡陽 421001；2.湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院護理學(xué)院內(nèi)科教研室)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

阿托伐他汀對血脂異常兔血清和脂肪組織脂聯(lián)素的影響

劉健1,2，吳潔1，李群芳2，羅文2

(1.南華大學(xué)第一臨床學(xué)院心血管內(nèi)科，湖南 衡陽 421001；2.湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院護理學(xué)院內(nèi)科教研室)

目的觀察阿托伐他汀干預(yù)下血脂異常兔血清脂聯(lián)素的水平以及脂肪組織過氧化物酶增殖體激活受體γ(PPARγ)和脂聯(lián)素分泌量的變化，推測阿托伐他汀抗動脈粥樣硬化的可能機制。方法將15只純種新西蘭大白兔隨機分為3組進行血脂造模。造模結(jié)束后，留取兔主動脈標(biāo)本并切片做HE染色，觀察動脈粥樣硬化斑塊的變化；取腹股溝皮下脂肪組織稱量，并進行脂肪組織孵育；應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)測定脂肪細胞過氧化物酶增殖體激活受體mRNA和脂聯(lián)素mRNA的表達；酶聯(lián)免疫吸附試驗測定血清及腹股溝脂肪細胞提取液中脂聯(lián)素濃度。結(jié)果阿托伐他汀組兔主動脈粥樣斑塊面積明顯低于高膽固醇組(P<0.05)；高膽固醇組兔血清低密度脂蛋白膽固醇、血清總膽固醇濃度明顯高于對照組(P<0.05)；阿托伐他汀藥物治療后能明顯降低兔血清低密度脂蛋白膽固醇以及總膽固醇濃度(P<0.05)；高膽固醇組兔血清脂聯(lián)素濃度和脂肪組織分泌的脂聯(lián)素濃度較對照組低(P<0.05)；阿托伐他汀藥物治療后能明顯升高血清脂聯(lián)素濃度并提高脂肪組織分泌脂聯(lián)素的濃度(與高膽固醇組比較，P<0.05)；血清脂聯(lián)素濃度與脂肪組織分泌的脂聯(lián)素濃度呈正相關(guān)(P<0.05)；RT-PCR結(jié)果顯示高膽固醇組脂肪組織過氧化物酶增殖體激活受體mRNA和脂聯(lián)素mRNA表達低于對照組(P<0.05)；阿托伐他汀組脂肪組織過氧化物酶增殖體激活受體mRNA和脂聯(lián)素mRNA的表達高于高膽固醇組(P<0.05)。結(jié)論阿托伐他汀能上調(diào)血脂異常兔脂肪組織過氧化物酶增殖體激活受體γ和脂聯(lián)素mRNA表達從而升高血清和脂肪組織脂聯(lián)素的分泌水平，這可能是阿托伐他汀抗動脈粥樣硬化作用的多效性機制之一。

血脂異常兔； 阿托伐他??； 脂聯(lián)素； 過氧化物酶增殖體激活受體γ

脂聯(lián)素(adiponectin,APN)是由脂肪組織分泌的一種脂肪因子，脂聯(lián)素在體內(nèi)的生理作用主要是抑制動脈粥樣硬化，增加胰島素敏感性，調(diào)節(jié)糖脂代謝[1]；此外，脂聯(lián)素還有重要的抗炎、血管保護作用[2]。過氧化物酶增殖體激活受體γ(peroxisome proliferation activated receptor gamma,PPARγ)是一種核轉(zhuǎn)錄因子，是核受體超家族成員之一，1990年首次發(fā)現(xiàn)PPARγ在脂肪細胞的分化中起重要的調(diào)控作用，又稱之為脂肪激活轉(zhuǎn)錄因子[3]，PPARγ是體內(nèi)糖與脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，且與炎癥、心血管疾病、糖尿病及腫瘤等多種疾病密切相關(guān)。阿托伐他汀是有明顯的調(diào)脂和改善胰島素抵抗的一種他汀類藥物，是冠心病、腦血管疾病的一級治療藥物[4-5]。阿托伐他汀可升高血清APN水平，但是否通過增加脂肪組織合成PPARγ從而增加APN分泌這條途徑尚不清楚。本研究通過觀察阿托伐他汀干預(yù)下血脂異常兔腹股溝脂肪組織PPARγ表達變化以及對APNmRNA表達和APN分泌的影響，試闡明阿托伐他汀升高血清APN濃度的可能機制。

1 材料與方法

1.1材料15只3月齡的健康新西蘭純種雄性大白兔(南華大學(xué)實驗動物中心提供)；阿托伐他汀鈣片(北京嘉林藥業(yè)股份有限公司)；膽固醇(上海耀景助劑有限公司)；DMEM/HamsF12培養(yǎng)液(Gibco公司)；10%胎牛血清(杭州四季青生物工程材料公司)；兔子APN ELISA試劑盒(上海朗頓生物科技有限公司)；TotalRNA提取試劑盒(TRIzol)(omega)；PCR擴增試劑盒(上海生物工程技術(shù)有限公司)。

1.2血脂異常兔模型建立15只新西蘭大白兔，平均體重2.0 kg,單籠喂養(yǎng)10天后，隨機分3組，分別為正常對照組、高膽固醇組、高脂+阿托伐他汀組(簡稱阿托伐他汀組)。每日總食量約為125 g，單籠飼養(yǎng)，所給飲食如下，飲水不限。正常對照組，5只普通飲食8周作對照；高膽固醇組，5只高脂飲食(2%膽固醇和6%豬油)喂養(yǎng)8周；阿托伐他汀組，5只高脂飲食(2%膽固醇和6%豬油)喂養(yǎng)4周，再高脂飲食+他汀類藥物(阿托伐他汀每天2.5 mg/kg)喂養(yǎng)4周，他汀類藥物混入高脂飲食中并觀察它們吃完。

1.3脂肪組織的培養(yǎng)3組兔喂養(yǎng)8周，10%水合氯醛5 mL肌肉注射麻醉。無菌條件下用無菌手術(shù)剪取兔雙腹股溝皮下脂肪組織，一側(cè)脂肪組織置于無菌去酶EP管內(nèi)，-70 ℃冰箱凍存，備用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-PCR)；另一側(cè)脂肪組織用于培養(yǎng)，具體方法見后述。參照脂肪組織培養(yǎng)有關(guān)方法，在無菌條件下取兔腹股溝皮下脂肪組織1 g，剪成20塊，每塊50 mg，經(jīng)冷PBS緩沖液清洗3次，剪碎置于EP管內(nèi)。按50 mg脂肪組織加1 mL培養(yǎng)液比例置于培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)液為DMEM/F12，其中含有10%熱滅活胎牛血清、青霉素(200 U/mL)、鏈霉素(50 μg/mL)，然后放入5%CO2培養(yǎng)箱中孵育12 h，收集組織上清液，放入-70 ℃冰箱保存待測。

1.4血脂的測定分別在飼養(yǎng)前及飼養(yǎng)至第4周和第8周時，在嚴格無菌條件下經(jīng)兔耳中央動脈取動脈血5 mL置于抗凝管中，靜置30 min后在離心機上4 000 r/min離心15 min,用移液槍取血清1 000 μL待測。在日立7600-020全自動生化儀上測定兔TC、TG、LDLC、HDLC的濃度。

1.5脂肪組織逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)使用TRIzol提取試劑盒抽提脂肪組織總RNA，采用紫外分光光度計測量其濃度。取純化后的總RNA 5 μL進行RT反應(yīng)。每一標(biāo)本取RT產(chǎn)物4 μL進行PCR反應(yīng)。兔APN基因序列(基因編號DQ334867)[7]上下游引物為5′-AAC CAC TAT GAC AGC ACC ACG-3′和 5′-AGA GAA GGA AGC CAG TGG AGA-3′，產(chǎn)物長度297 bp；兔脂肪組織中PPARγ引物基因序列(基因收錄號AF013266)[6]上下游引物5′-TGC AGG AGC AGA GCA AAG AAG-3′和5′-GAG GCC AGC ATG GTG TAG ATG-3′，產(chǎn)物長度為187 bp；同時以GAPDH為反應(yīng)內(nèi)參，在Gnebank中查找到兔內(nèi)參照GAPDH基因序列[7]上下游引物:5′-GCG CCT GGT CAC CAG GGC TGC TT-3′和5′-TGC CGA AGT GGT CGT GGA TGA CCT-3′,產(chǎn)物長度為465 bp，引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成，擴增片段為297 bp.反應(yīng)參數(shù)為94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，58 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸 10 min，共30循環(huán)，72 ℃終止延伸10 min，于-20 ℃保存。取PCR引物4 μL經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，照相并經(jīng)光密度儀掃描分析，以內(nèi)對照吸光度值進行標(biāo)準(zhǔn)校正，計算出APN的相對量。

1.6脂聯(lián)素水平的檢測采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(雙抗體夾心法)檢測血清及脂肪細胞上清液中脂聯(lián)素(APN)水平，其批內(nèi)、批間的變異系數(shù)均<10%,每份樣品均設(shè)復(fù)孔。

2 結(jié) 果

2.1三組兔主動脈血管斑塊面積的變化第8周3組兔主動脈粥樣斑塊面積(肉眼所見)：對照組0.01±0.02 mm2，高膽固醇組6.20±0.43 mm2，阿托伐他汀組4.90±0.28 mm2，與高膽固醇組相比，阿托伐他汀組斑塊面積明顯減小，兩者相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。各組兔主動脈HE染色結(jié)果顯示：對照組動脈血管內(nèi)皮完整；高膽固醇組血管內(nèi)膜明顯增厚，出現(xiàn)纖維帽斑塊，內(nèi)膜中大量巨噬細胞浸潤，內(nèi)有脂質(zhì)沉積，形成泡沫細胞，并伴有中層平滑肌細胞增生;阿托伐他汀組內(nèi)膜增厚和脂質(zhì)沉積較高膽固醇組減輕(圖1，表1)。

圖1 三組兔主動脈血管HE染色圖片(HE，ⅹ100)

表1三組兔脂質(zhì)斑塊面積的比較(mmol/L)

組別n實測面積實測面積/主動脈總面積對照組50.01±0.02mm31.0%高膽固醇組56.20±0.43mm248.9%a阿托伐他汀組54.90±0.28mm234.2%a,b

與對照組比較，a：P<0.05；與高膽固醇組比較，b:P<0.05

2.2三組兔血脂的變化三組兔0周時膽固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low denitylipoprotein cholesterol,LDLC)、高密度脂蛋白膽固醇(high denity lipoprotein cholesterol,HDLC)、甘油三酯(triglyceride，TG)濃度組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。高脂飲食4周后，高膽固醇組和阿托伐他汀組TC、LDLC濃度均明顯高于對照組(P<0.05)；阿托伐他汀組治療4周后TC和LDLC濃度較高膽固醇組明顯減低，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)(表2)。

表2三組兔血脂水平的比較(mmol/L)

血脂時間對照組(n=5)高膽固醇組(n=5)阿托伐他汀組(n=5)TC0周1.40±0.151.35±0.141.45±0.124周1.45±0.1427.39±2.83a28.60±2.48a8周1.51±0.1728.80±2.20a15.40±3.53abLDLC0周0.64±0.180.73±0.190.67±0.134周0.66±0.1218.74±2.75a19.45±2.01a8周0.63±0.1419.92±2.70a10.07±1.53abHDLC0周0.62±0.070.70±0.100.64±0.094周0.63±0.060.67±0.050.69±0.148周0.68±0.110.70±0.080.73±0.13TG0周1.23±0.131.16±0.141.14±0.154周1.34±0.181.35±0.121.41±0.198周1.41±0.111.48±0.171.32±0.16

與對照組比較，a:P<0.05；與高膽固醇組比較，b：P<0.05

2.3血清及脂肪組織APN濃度的變化高膽固醇組兔血清脂聯(lián)素濃度和脂肪組織分泌的脂聯(lián)素濃度較對照組低(P<0.05)；阿托伐他汀藥物治療后能明顯升高血清脂聯(lián)素濃度并提高脂肪組織分泌脂聯(lián)素的濃度(與高膽固醇組比較，P<0.05)(表3)。

2.4血清APN與脂肪組織APN的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析顯示血清APN水平與脂肪組織APN的分泌水平呈明顯正相關(guān)(n=15，r=0.882，P<0.05)(圖2)。

圖2 第8周血清與脂肪組織APN濃度的相關(guān)性(呈正相關(guān))

表3各組兔血清及脂肪組織APN水平的變化(mg/L)

組別n脂肪組織血清0周4周8周對照組53.887±0.4441.418±0.1591.416±0.1471.417±0.149高膽固醇組52.957±0.358a1.457±0.1581.253±0.150a1.188±0.125a阿托伐他汀組56.584±0.674ab1.434±0.1401.268±0.138a1.359±0.158b

與對照組比較，a：P<0.05；與8周時高膽固醇組比較，b：P<0.05

2.5脂肪組織PPARγmRNA與APNmRNA表達的變化

2.5.1 脂肪組織PPARγmRNA的表達 三組兔脂肪組織PPARγmRNA均有表達，對照組為0.69±0.04,高膽固醇組為0.65±0.28，阿托伐他汀組為0.82±0.52，高膽固醇組PPARγmRNA的表達較對照組降低(P<0.05)，而阿托伐他汀組脂肪組織細胞中PPARγmRNA的表達較高膽固醇組升高(P<0.05)(圖3)。

2.5.2 脂肪組織APN mRNA表達 三組兔脂肪組織APNmRNA均有表達，對照組為0.82±0.05,高膽固醇組為0.79±0.03，阿托伐他汀組為0.95±0.04。高膽固醇組APNmRNA的表達較對照組降低(P<0.05)，而阿托伐他汀組脂肪組織APNmRNA的表達較高膽固醇組升高(P<0.05)(圖4)。

圖3 脂肪組織PPARγmRNA的表達 1：對照組；2：高膽固醇組；3：阿托伐他汀組. 與對照組比較，*：P<0.05；與高膽固醇組比較，#：P<0.05

3 討 論

眾多的研究結(jié)果證明APN在人體的脂質(zhì)代謝中發(fā)揮著重要影響，并在能量的平衡與控制方面起著重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)高膽固醇組脂肪組織PPARγmRNA以及APNmRNA的表達較對照組均明顯降低，阿托伐他汀組脂肪組織PPARγmRNA以及APNmRNA的表達較高膽固醇組均明顯升高；高膽固醇組血清APN水平和脂肪組織APN的分泌較高膽固醇組明顯減少，而阿托伐他汀組血清APN水平和脂肪組織APN的分泌較高膽固醇組明顯升高。

由于血清APN與脂肪組織APN濃度呈正相關(guān)，顯示血清APN主要來源于脂肪組織APN的分泌，提示高膽固醇飲食有可能通過降低脂肪組織PPARγmRNA的表達并進一步調(diào)控脂肪組織APNmRNA的表達及分泌來降低血清APN水平；阿托伐他汀有可能通過升高脂肪組PPARγmRNA的表達并進一步調(diào)控脂肪組織APNmRNA的表達及分泌來升高血清APN水平。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀除了通過抑制HMG-CoA還原酶的活性，發(fā)揮調(diào)脂抗動脈粥樣硬化作用外，還能明顯上調(diào)高脂血癥兔皮下脂肪組織PPARγ和APNmRNA的表達，增加脂肪組織APN的分泌水平及血清APN濃度，這一作用可能是阿托伐他汀藥物抗動脈粥樣硬化的另一條重要作用機制。

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TheInfluencesofAtorvastatinonLevelsofAdiponectininSerumandAdiposeTissueofDyslipidemiaRabbits

LIU Jian，WU Jie，LI Qunfang，et al

(DepartmentofCardiology,theFirstClinicalCollegeofUniversityofSouthChina，Hengyang,Hunan421001，China)

ObjectiveTo observe the changes of serum adiponectin(APN)level,peroxisome proliferation activated receptor gamma(PPARγ) and APN secretion in adipose tissues of dyslipidemia rabbits under atorvastatin intervention and to elaborate the possible anti-atherosclerosis mechanism of atorvastatin.MethodsFifteen pure New Zealand white rabbits were randomly divided into three groups to make lipid models.Then the Aortic specimens were obtained and sectioned to make HE staining and the atherosclerotic plaque changes were observed.The inguinal subcutaneous adipose tissues were obtained and weighed and incubation of adipose tissues was made.Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) technology was applied to determine the expression of peroxisome proliferation activated receptor mRNA and adiponectin mRNA in fat cells.Enzyme linked immunosorbent assay was applied to determine the concentration of serum and the adiponectin in the extract from the inguinal fat cells.ResultsThe aortic atherosclerotic plaque area in the rabbits of the atorvastatin group was significantly lower than that in the rabbits of the high cholesterol group(P<0.05).The concentration of the low density lipoprotein cholesterol (LDL-C) and the total cholesterol (TC) in the serum of the rabbits of the high cholesterol group was significantly higher than that in the contrast group(P<0.05).Atorvastatin drug intervention for 4 weeks can significantly reduce the concentration of the low density lipoprotein cholesterol (LDL-C) and the total cholesterol (TC) in the serum of the rabbits (compared before and after the treatment,P<0.05).Serum APN concentration and the concentration of the APN secreted from adipose tissues in the rabbits of the high cholesterol group were lower than those in the contrast group (P<0.05).Atorvastatin drug intervention could significantly raise serum APN concentration and the concentration of the APN secreted from adipose tissues (compared with high cholesterol group,P<0.05).The serum APN concentration and the concentration of the APN secreted from adipose tissues were positively correlated(P<0.05).RT-PCR results showed that the expression of peroxisome proliferation activated receptor mRNA and adiponectin mRNA in fat cells of the rabbits in the high cholesterol group was lower than that in the contrast group(P<0.05) and the expression of peroxisome proliferation activated receptor mRNA and adiponectin mRNA in the atorvastatin group was higher than that in the high cholesterol group(P<0.05).ConclusionAtorvastatin increases the expression of peroxisome proliferation activated receptor gamma(PPARγ)and adiponectin mRNA in the adipose tissues of dyslipidemia rabbits,thus improving the secreting level of serum and adiponectin in fat cells,which may be one of the pleiotropic anti-atherosclerotic mechanisms of atorvastatin.

dyslipidemia rabbit； atorvastatin； adiponectin； peroxisome proliferation activated receptor gamma

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.04.007

2014-09-11；

2015-04-15

衡陽市科技局基金項目(2013KS65).

R54

A

(此文編輯：朱雯霞)