WIF-1、DKK基因啟動(dòng)子甲基化對(duì)COLO 320、HT-29細(xì)胞株β-catenin磷酸化的影響

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(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南 衡陽 421001)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

WIF-1、DKK基因啟動(dòng)子甲基化對(duì)COLO 320、HT-29細(xì)胞株β-catenin磷酸化的影響

周徽，胡光勝，曾斌，廖愛軍

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南 衡陽 421001)

目的探討Wnt抑制性基因甲基化對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞株Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響。方法使用甲基特異性PCR和逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR方法，分別檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞株COLO 320、HT-29及正常細(xì)胞株CCD-18Co中WIF-1、DKK-1、DKK-3的啟動(dòng)子CpG島甲基化、mRNA水平，和測(cè)定β-catenin蛋白磷酸化情況，并觀察5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-aza-dC)去甲基化對(duì)各指標(biāo)的影響。結(jié)果COLO 320細(xì)胞的DKK-1及DKK-3 mRNA水平明顯降低、甲基化程度高；HT-29細(xì)胞的DKK-3、WIF-1 mRNA水平低、甲基化程度高；兩個(gè)腫瘤細(xì)胞株的β-catenin蛋白總量均明顯增高，且主要為非磷酸化的狀態(tài)。5-aza-dC可減少這些指標(biāo)的改變。結(jié)論抑制性基因甲基化調(diào)節(jié)的Wnt/β-catenin通路的異常激活，可能在結(jié)直腸癌的形成中有重要作用。在不同的腫瘤細(xì)胞株之間、不同Wnt抑制基因的甲基化程度存在差異；該領(lǐng)域的深入研究有助于開發(fā)出新的治療藥物。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路； 甲基化； 結(jié)直腸癌； 表觀遺傳學(xué)

Wnt信號(hào)通路在多細(xì)胞生物中高度保守，在胚胎發(fā)育、內(nèi)環(huán)境自穩(wěn)和腫瘤發(fā)生等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。例如，經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常激活是大多數(shù)結(jié)直腸癌的早期事件，其中約80%患者攜帶有導(dǎo)致APC(adenomatous polyposis coli)基因功能缺失的突變，5%攜帶有引起β-catenin活化的突變[1- 2]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路還是腫瘤維持和轉(zhuǎn)移所必需的[3]。

在Wnt/β-catenin信號(hào)通路的上游，Wnt拮抗物的失活與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。Wnt的拮抗物主要有兩大類：能直接結(jié)合Wnt蛋白、抑制Wnt/β-catenin通路活性的WIF-1(Wnt抑制因子-1)、sFRP家族等；以及能結(jié)合Wnt受體復(fù)合物中的低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5和6(LRP 5/LRP 6)的DKK(Dickkopfs)家族。已證明WIF-1[4]、sFRP[5]和DKK[6]的表觀遺傳學(xué)改變以及表達(dá)異常與消化道腫瘤密切相關(guān)。本文則著重觀察在不同結(jié)直腸癌細(xì)胞株中，WIF-1與DKK基因啟動(dòng)子的甲基化、mRNA及蛋白的水平，及其對(duì)β-catenin水平的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞系結(jié)直腸腺癌細(xì)胞系COLO 320、HT-29均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(湖北省武漢市)：正常的結(jié)直腸細(xì)胞株CCD-18Co(CRL-1459)購自美國ATCC。細(xì)胞培養(yǎng)基為10%胎牛血清的DMEM。

1.2去甲基化處理收集對(duì)數(shù)增長期的培養(yǎng)細(xì)胞,使用5 μmol/L 的5-氮雜-2′-脫氧胞嘧啶核苷 (5-aza-2′-deoxycytidine，5-aza-dC，Sigma-Aldrich) 孵育72 h以進(jìn)行去甲基化處理。處理結(jié)束后立即收集細(xì)胞提取RNA進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 RNA的提取、逆轉(zhuǎn)錄和WIF-1、DKK的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR定量檢測(cè)每個(gè)樣品使用約106個(gè)細(xì)胞，使用QIAamp RNA mini kit (Qiagen)按說明提取總RNA；使用SuperScript Ⅲ及隨機(jī)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；使用TaqMan universal PCR master mix(Applied Biosystems)，按說明書及參照文獻(xiàn)[7]，對(duì)以下基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR定量檢測(cè)。DKK-1(TaqMan Gene Expression Assay)；DKK-3(正向引物：5′-GTA AGT TTC CCC TCT GGC TTG-3′,反向引物：5′-AAG CAC CAG ACT GTG AAG CCT-3′，探針：FAM-5′- AGG TGT TGT GCA TTT GTT CAG CTC CC-3′-TAMRA)；WIF-1(正向引物：5′-TCC AAA CAC CTC AAA ATG CTA TC-3′，反向引物：5′-GAA CCC ATC AGG ACA CTC GC-3′，探針：FAM-5′-ACA AGC TGA GTG CCC AGG CGG-3′-TAMRA)和內(nèi)參GAPDH(正向引物：5′-CCA CTC CTC CAC CTT TGA C-3′,反向引物：5′-ACC CTG TTG CTG TAG CCA-3′，探針：FAM-5′-TTG CCC TCA ACG ACC ACT TTG TC-3′-TAMRA)。使用ABI 7500進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min和35 個(gè)周期的95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s。每個(gè)樣品測(cè)3個(gè)重復(fù)孔。數(shù)據(jù)分析時(shí)參考文獻(xiàn)[8]，計(jì)算靶基因與GAPDH 參照基因Ct值的比值。

1.4 DNA的提取和甲基化特異PCR(MSP)檢測(cè)

采用QIAamp DNA mini kit (Qiagen) 提取、純化培養(yǎng)的腸癌細(xì)胞和正常細(xì)胞CCD-18Co的DNA。按文獻(xiàn)方法[9]使用亞硫酸氫鹽對(duì)DNA進(jìn)行修飾并進(jìn)行MSP檢測(cè)。引物序列參照文獻(xiàn)[6,9]分別為：

甲基化特異的引物：DKK-1： 5′-CGT TCG TTG GTA GTT TTT ATT TCG A-3′ (正向)； 5′-GCG ACT ACC TTT ATA CCG CGA A-3′(反向)；DKK-3： 5′-CGG TTT TTT TTC GTT TTC GGG-3′(正向)，5′-CAA ACC GCT ACA TCT CCG CT-3′(反向)；WIF-1：5′-GGG CGT TTT ATT GGG CGT AT-3′(正向)，5′-AAA CCA ACA ATC AAC GAA C-3′ (反向)。

非甲基化的特異引物為:DKK-1：5′-TGT TTG TTG GTA GTT TTT ATT TTG A-3′，5′-ACC ACA ACT ACC TTT ATA CCA CAA A-3′；DKK-3：5′-TTT TGG TTT TTT TTT GTT TTT GGG-3′；5′ -CCA AAC CAC TAC ATC TCC ACT-3′；WIF-1：5′-GGG TGT TTT ATT GGG TGT AT-3′(forward)，5′-AAA CCA ACA ATC AAC AAA AC-3′(reverse) 。主要步驟為：PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性 12 min：94 ℃變性 1 min，退火 45 s，72 ℃延伸 40 s，40個(gè)循環(huán)后 72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。使用正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)提取的DNA經(jīng)SssI甲基化酶處理后作為甲基化分析的陽性對(duì)照，未經(jīng)處理的作為非甲基化的陰性對(duì)照。 甲基化(M)和非甲基化(U)特異PCR的產(chǎn)物電泳后，使用TANON GIS凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，計(jì)算其光密度的相對(duì)比例。

1.5 β-catenin的Westernblot檢測(cè)將106細(xì)胞直接以收集細(xì)胞加入裂解液裂解后收集上清，以BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度后,將蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分離,并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜(Immobilon-P,Millipore)上，采用5%脫脂奶粉室溫封閉3 h，進(jìn)行抗體標(biāo)記。 所用抗體為小鼠anti-β-catenin (BD Transduction Laboratories)、小鼠anti-Actin (Sigma)、兔多克隆抗人DKK-1、DKK-3、WIF-1(Abcam)和兔抗人磷酸化β-catenin (pS33/pS37/pT41) (Cell Signalling Technologies)，以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG、兔抗小鼠IgG(Abcam)。使用ECL Western blotting 檢測(cè)試劑 (Pierce)進(jìn)行顯色及VersaDoc MP4000 (Bio-rad)進(jìn)行分析。

1.6統(tǒng)計(jì)分析使用IBM SPSS version 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間比較采用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1不同細(xì)胞株中WIF-1、DKK-1、DKK-3 mRNA表達(dá)的改變根據(jù)不同靶基因?qū)APDH基因的比值，以正常細(xì)胞CCD-18Co為參照，計(jì)算出COLO320和HT-29不同基因的改變倍數(shù)。圖1可以看出COLO320細(xì)胞的DKK-1和DKK-3 mRNA表達(dá)明顯下降(P<0.01)；而WIF-1改變不明顯。而HT-29細(xì)胞的DKK-3 和WIF-1 mRNA水平明顯下降(P<0.01)，DKK-1改變不明顯。而經(jīng)5-aza-dC干預(yù)后，均有所回調(diào)，但依然明顯低于正常細(xì)胞。

2.2不同細(xì)胞株中WIF-1、DKK-1、DKK-3啟動(dòng)子甲基化程度的檢測(cè)使用甲基化特異PCR以及非甲基化特異PCR進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CCD-18Co的WIF-1、DKK-1、DKK-3等3個(gè)基因啟動(dòng)子均處于非甲基化狀態(tài)；COLO320的DKK-1和DKK-3基因啟動(dòng)子處于高度甲基化、WIF-1處于非甲基化狀態(tài)；而HT-29的DKK-3和WIF-1基因啟動(dòng)子處于高度甲基化，DKK-1處于非甲基化狀態(tài)。

圖1 不同細(xì)胞株中WIF-1、DKK-1、DKK-3 mRNA表達(dá)的改變 注：相對(duì)于未經(jīng)5-aza-dC處理的CCD-18Co細(xì)胞株(標(biāo)化為“1”)，DKK-1(A)、DKK-3(B)和WIF-1(C)mRNA在COLO320、HT-29細(xì)胞中表達(dá)的水平及經(jīng)5-aza-dC處理后改變的倍數(shù)

經(jīng)5-aza-dC干預(yù)后，CCD-18Co的3個(gè)基因依然保持于非甲基化的狀態(tài)；而COLO320高甲基化的DKK-1、DKK-3均明顯減弱，并擴(kuò)增出了部分未甲基化的條帶。相似的，HT-29高甲基化的DKK-3和WIF-1在5-aza-dC干預(yù)后，也出現(xiàn)了MSP條帶減弱、并擴(kuò)增出了非甲基化的條帶(圖2)。

2.3不同細(xì)胞株中DKK-1、DKK-3和WIF-1蛋白的表達(dá)使用Western Blot對(duì)不同細(xì)胞株DKK-1、DKK-3和WIF-1蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行分析，研究發(fā)現(xiàn)，CCD-18Co的DKK-1、DKK-3和WIF-1蛋白均處于較高表達(dá)水平，5-aza-dC處理后無明顯改變。COLO 320 表達(dá)DKK-1和WIF-1微弱；5-aza-dC處理后DKK-1明顯增強(qiáng)、WIF-1也略有增加但依然處于極低水平。DKK-3則始終有較高表達(dá)。而HT-29的DKK-1表達(dá)處于較高水平，DKK-3和WIF-1表達(dá)微弱，5-aza-dC處理后略有增加(圖3)。

圖2 不同細(xì)胞株中WIF-1、DKK-1、DKK-3 基因甲基化的狀態(tài) 注：M：甲基化特異PCR。U：非甲基化特異PCR?！?”為5-aza-dC處理組；“-”為未處理組。Control為陽性對(duì)照(M.DNA：甲基化的DNA)和陰性對(duì)照(PBMC：正常人PBMC提取的 DNA)

圖3 不同細(xì)胞株中DKK-1、DKK-3和WIF-1蛋白的表達(dá)水平 注：“+”為5-aza-dC處理組；“-”為未處理組

2.4 β-catenin含量分析Wnt/β-catenin的異?；罨罱K體現(xiàn)為β-catenin的磷酸化減少、以及隨后的泛素化降解減少。而在本文中相對(duì)于CCD-18Co細(xì)胞，COLO320和HT-29細(xì)胞都存在β-catenin總量增高、且Ser33/37和Thr41磷酸化β-catenin水平低的情況，提示非磷酸化的β-catenin增高。而經(jīng)5-aza-dC干預(yù)后，COLO320和HT-29細(xì)胞β-catenin總量均降低、磷酸化β-catenin含量升高(圖4)。

3 討 論

Wnt信號(hào)經(jīng)典通路——Wnt/β-catenin通路在多個(gè)重要的生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。Wnt/β-catenin通路主要為：在存在Wnt活化信號(hào)時(shí)，Wnt結(jié)合至其受體frizzled(Fzd)和LRP 5/LRP 6，阻止了β-catenin被AXIN/ APC/ GSK3/ CK1復(fù)合體磷酸化、進(jìn)而被泛素化及蛋白酶體降解。因此，

圖4 不同細(xì)胞株中β-catenin和磷酸化-β-catenin的水平注：“+”為5-aza-dC處理組；“-”為未處理組

β-catenin在胞質(zhì)中聚集、并轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，作為轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF家族的輔因子，導(dǎo)致多個(gè)Wnt/β-catenin靶基因的轉(zhuǎn)錄，如Axin2、Smad7、Ccnd1/CyclinD和Myc等。因此，如能影響Wnt抑制因子的表達(dá)，則可能在Wnt/β-catenin通路上游抑制該通路的激活，產(chǎn)生包括抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移在內(nèi)的廣泛的調(diào)節(jié)作用。

基因的表觀遺傳學(xué)修飾是一種不依賴DNA序列改變的、可逆的基因表達(dá)調(diào)控過程。基因啟動(dòng)子甲基化等表觀遺傳學(xué)修飾與癌癥的發(fā)生密切相關(guān)[10-11]。本研究則進(jìn)一步證實(shí)，在結(jié)直腸癌細(xì)胞株COLO320及HT-29中，Wnt抑制基因的mRNA表達(dá)、基因啟動(dòng)子高度甲基化與相應(yīng)的蛋白表達(dá)水平基本吻合。如COLO320的DKK-1和DKK-3 mRNA較低，其基因啟動(dòng)子也處于高甲基化狀態(tài)，蛋白表達(dá)也相應(yīng)較低。而HT-29中DKK-3和WIF-1的表達(dá)情況與之類似。同時(shí)，COLO320和HT-29的β-catenin總量均有所增加、磷酸化的β-catenin減少。

本研究的結(jié)果說明，這兩個(gè)結(jié)直腸癌細(xì)胞株中，均存在Wnt抑制基因的甲基化修飾異常、以及Wnt/β-catenin通路異?；罨＿@一改變可能參與了結(jié)直腸癌的形成。因此，已有研究嘗試以糞便檢查SFRP1和WIF-1基因甲基化的程度來幫助篩查腸癌[12]。本研究還發(fā)現(xiàn)，在COLO320、HT-29這兩個(gè)不同的結(jié)直腸癌細(xì)胞珠中，不同Wnt抑制基因的甲基化和轉(zhuǎn)錄水平是存在差異的；而去甲基化處理可以部分下調(diào)Wnt/β-catenin通路的異常活化。提示該通路可能成為新的結(jié)直腸癌的治療靶點(diǎn)。

[1] Cancer Genome Atlas Network.Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer[J].Nature,2012,487(7407):330-337.

[2] Humphries A,Wright NA.Colonic crypt organization and tumorigenesis[J].Nat Rev Cancer,2008,8(6):415-424.

[3] Scholer-Dahirel A,Schlabach MR,Loo A,et al.Maintenance of adenomatous polyposis coli (APC)-mutant colorectal cancer is dependent on Wnt/beta-catenin signaling[J].Proc Natl Acad Sci USA,2011,108(41):17135-17140.

[4] 王玲,張煦,王連.大腸癌中WIF-1和Wnt2b的表達(dá)及其臨床意義[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2012,28(06):613-615，619.

[5] 譚華斌,盧光新.胃癌組織中SnoN、Egr3和SFRP1的表達(dá)情況及臨床意義[J].臨床腫瘤學(xué)雜志,2014,19(10):901-905.

[6] 李春輝,潘理會(huì),佟曉波,等.Wnt信號(hào)通路的組件蛋白DKK-1、β-鏈接素及周期素D1蛋白表達(dá)與胃癌的相關(guān)性[J].中國老年學(xué)雜志,2015,35(05):1171-1173.

[7] Ding Z,Qian YB,Zhu LX,et al.Promoter methylation and mRNA expression of DKK-3 and WIF-1 in hepatocellular carcinoma[J].World J Gastroenterol,2009,15(21):2595-2601.

[8] Schmittgen TD,Livak KJ.Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method[J].Nat Protoc,2008,3(6):1101-1108.

[9] Mazieres J,He B,You L,et al.Wnt inhibitory factor-1 is silenced by promoter hypermethylation in human lung cancer[J].Cancer Res,2004,64(14):4717-4720.

[10] Yamamoto E,Suzuki H,Takamaru H,et al.Role of DNA methylation in the development of diffuse-type gastric cancer[J].Digestion,2011,83(4):241-249.

[11] Voorham QJ,Janssen J,Tijssen M,et al.Promoter methylation of Wnt-antagonists in polypoid and nonpolypoid colorectal adenomas[J].BMC Cancer,2013,13(19):603.

[12] 張虎,張平,江軍,等.糞便標(biāo)本中SFRP1和WIF-1基因啟動(dòng)子甲基化在大腸癌早期篩查中的意義[J].山東醫(yī)藥,2014,54(33):54-56.

HypermethylationofWIF-1andDKKGeneFamilyontheβ-cateninPhosphorylationinColorectalAdenocarcinomaCellLinesCOLO320andHT-29

ZHOU Hui,HU Guangsheng,ZENG Bin,et al

(DepartmentofDigestion,theFirstAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo reveal the the effect of methylated inhibitory genes on Wnt/β-catenin pathway in colorectal adenocarcinoma cell lines.MethodsWith colorectal adenocarcinoma cell lines COLO 320,HT-29 and normal colorectal cell line cCCD-18Co,methylation status of CpG island in promotor of WIF-1,DKK-1 and DKK-3 genes were determined by methylation specific PCR (MSP),and mRNA levels of these genes were quantified by real-time RT-PCR,and phosphorylated β-catenin were semi-quantified by Western blot.Effect of DNA-demethylating agent 5-aza-2′-deoxycytidine (5-aza-dC) treatment were also evaluated.ResultsDKK-1and DKK-3 mRNA decreased accompanied with hypermethylation status of the CpG islands in COLO 320,while DKK-3 and WIF-1 mRNA decreased accompanied with hypermethylation in HT-29.Total β-catenin increased significantly while phosphorylated β-catenin declined in both cell lines.5-aza-dC ameliorated these aberrant parameters partially.ConclusionThe aberrant activation of Wnt/β-catenin pathway mediated by the hypermethylation of WIF-1 and DKKs genes may contribute to the oncogenesis of colorectal adenocarcinoma,while the methylation level of different Wnt inhibitory genes varied in colorectal cancer cell lines.Further research on this field will prompt the development of new therapies targeting the methylation process.

WNT/β-catenin signaling pathway； hypermethylation； colorectal adenocarcinoma； epigenetics

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.04.006

2015-04-30；

2015-06-12

衡陽市科學(xué)技術(shù)局科技計(jì)劃(編號(hào)：2011KJ64).

Q279

A

(此文編輯：蔣湘蓮)