溫度對(duì)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的影響

趙卓，嵇雅茹，籍浩天，趙海榮，郝錫聯(lián)(吉林師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林四平136000)

蛋白質(zhì)是構(gòu)成生物體細(xì)胞組織的重要成分，在生命體內(nèi)參與細(xì)胞構(gòu)建、物質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)、營(yíng)養(yǎng)代謝、激素調(diào)控和酶促反應(yīng)等多種生命活動(dòng)，在生物體發(fā)育過(guò)程中幾乎參與所有重大生命事件［1－2］。因此，對(duì)蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，是生命科學(xué)研究領(lǐng)域中最常用檢測(cè)手段，對(duì)其定性、定量分析是功能分析、食品檢驗(yàn)、疾病診斷、臨床檢驗(yàn)中最基礎(chǔ)的分析方法之一。目前，常用的蛋白質(zhì)測(cè)定方法有凱氏定氮法、Folin-酚試劑法、紫外吸收法、雙縮脲法、考馬斯亮藍(lán)染色法等［3－6］。鑒于每種蛋白質(zhì)測(cè)定方法都有各自的局限性和優(yōu)缺點(diǎn)，不能在任何條件下適用于各種蛋白質(zhì)類型檢測(cè)，需考慮到測(cè)定過(guò)程中的干擾物質(zhì)、蛋白質(zhì)性質(zhì)、外界環(huán)境理化因子影響等多種因素，為提升蛋白質(zhì)測(cè)定結(jié)果的精準(zhǔn)性，需要對(duì)蛋白質(zhì)不同的測(cè)定方法進(jìn)行條件優(yōu)化與篩選［7－8］。

自1976年Bradford發(fā)明快速測(cè)定微克量蛋白質(zhì)的考馬斯亮藍(lán)法(G250)以來(lái)，考馬斯亮藍(lán)法便以靈敏、精準(zhǔn)、便捷等測(cè)定優(yōu)勢(shì)得到迅速的推廣和廣泛的應(yīng)用［9－11］。考馬斯亮藍(lán)染料在游離狀態(tài)下呈棕紅色，當(dāng)與蛋白質(zhì)結(jié)合后呈藍(lán)青色，蛋白質(zhì)含量為0～1 000 μg范圍內(nèi)時(shí)，蛋白質(zhì)與色素結(jié)合物在595 nm下的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比?？捡R斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)在于:其一靈敏度高，據(jù)估計(jì)，考馬斯亮藍(lán)法比紫外吸收法靈敏10～20倍，比Biuret法靈敏100倍，比Lowry法約高4倍［10］;其二，測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，只需加一種染液，由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合過(guò)程只需2 min即可完成蛋白質(zhì)含量測(cè)定［11－12］;其三，干擾物少提升了測(cè)定結(jié)果的精準(zhǔn)性。所以，考馬斯亮藍(lán)法自問(wèn)世以來(lái)對(duì)蛋白質(zhì)含量測(cè)定得到學(xué)術(shù)界廣泛接受和認(rèn)同［12］。

蛋白質(zhì)定量測(cè)定是科研、臨床檢驗(yàn)中的常見(jiàn)實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)，測(cè)定精確與否對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響至關(guān)重要。盡管考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)具有快速、靈敏度高、穩(wěn)定以及測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確等諸多優(yōu)點(diǎn)，但在蛋白質(zhì)的測(cè)定過(guò)程中仍存在很多因素影響蛋白質(zhì)測(cè)定的準(zhǔn)確性，諸如溫度、光照等環(huán)境因子會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)測(cè)定產(chǎn)生不同程度的影響，研究顯示，溫度對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)晶具有重要影響［13］。目前未見(jiàn)有關(guān)溫度與考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度精準(zhǔn)關(guān)系方面的研究報(bào)道。該研究以已知蛋白濃度為測(cè)試樣品，研究溫度在考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度過(guò)程中的影響因子和作用程度，為今后科研工作中測(cè)定蛋白質(zhì)濃度準(zhǔn)確性提供建議和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的配制 稱取牛血清白蛋白10 mg，溶于蒸餾水并定容至100 ml，制成100 μg/ml的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液，存放于棕色瓶中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 考馬斯亮藍(lán)的制備 稱取G250染料100 mg，溶于50 ml 95%乙醇中，加入85%的磷酸100 ml，磁力攪拌至全部溶解后，蒸餾水定容至1 000 ml，過(guò)濾后置于棕色試劑瓶中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的建立 取6支試管，分別加入0.2～1.0 ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液和蒸餾水混勻后，向各管中加入5 ml G250溶液。充分搖勻，混合后靜置2 min左右，在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得線性回歸方程。

1.4 配置不同濃度的牛血清蛋白 準(zhǔn)確配置濃度為100、75、50、25、5 μg/ml的牛血清蛋白，置于棕色瓶中，于 4 ℃冰箱中保存。

1.5 不同溫度處理蛋白質(zhì)濃度測(cè)定 取各濃度蛋白質(zhì)溶液1 ml，加入5 ml G250 溶液混合后在 0、10、20、30、40、50 ℃條件下孵育，以蒸餾水為空白對(duì)照，分光光度計(jì)測(cè)定OD595值，每隔10 min測(cè)得數(shù)據(jù)。5次重復(fù)。

1.6 數(shù)據(jù)分析與繪圖 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量，試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行ANOVA分析，圖中數(shù)據(jù)采用Mean表示，顯著水平P≤0.05。

2 結(jié)果分析

2.1 不同溫度處理下5 mg/ml蛋白質(zhì)濃度動(dòng)態(tài)變化 表1表明，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度為5 mg/ml時(shí)，在溫度為0℃時(shí)，蛋白質(zhì)濃度測(cè)定值為10.95 μg/ml，與標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度比誤差百分比達(dá)到118.93%;當(dāng)溫度為10～30℃時(shí)，蛋白質(zhì)濃度測(cè)定值顯著升高，與標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度比誤差百分比達(dá)到156.8%以上;當(dāng)溫度為40～50℃時(shí)，蛋白質(zhì)濃度測(cè)定值升高極顯著，與標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度比誤差百分比高達(dá)215%以上。此外，各溫度條件下，蛋白質(zhì)濃度測(cè)定值都會(huì)隨孵育時(shí)間的延長(zhǎng)顯著增加，其中40℃孵育30 min和50℃孵育20 min后蛋白質(zhì)濃度超出分光光度計(jì)測(cè)定范圍。

表1 不同溫度對(duì)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定5 mg/ml蛋白質(zhì)濃度的動(dòng)態(tài)影響

2.2 不同溫度處理下25 mg/ml蛋白質(zhì)濃度動(dòng)態(tài)變化 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度為25 mg/ml時(shí)(表2)，在溫度為0℃時(shí)，蛋白質(zhì)濃度測(cè)定值為20.13 μg/ml，與標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度比誤差百分比為19.47%。當(dāng)溫度為10℃時(shí)，蛋白質(zhì)濃度測(cè)定值仍較低，與標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度比誤差百分比達(dá)到28.84%;當(dāng)溫度為20～30℃時(shí)，蛋白質(zhì)濃度測(cè)定值顯著升高，與標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度比誤差百分比為9.65% ～11.24%;當(dāng)溫度為40～50℃時(shí)，蛋白質(zhì)濃度測(cè)定值顯著降低，與標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度比誤差百分比為8.78% ～12.4%。此外，隨著蛋白質(zhì)與染料孵育時(shí)間延長(zhǎng)，0～10℃時(shí)蛋白質(zhì)濃度測(cè)定值顯著降低、誤差百分比顯著增加，20℃時(shí)蛋白質(zhì)濃度測(cè)定值降低、誤差百分比出現(xiàn)先降低后增加的趨勢(shì)，在30 min孵育時(shí)最接近標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度誤差百分比僅為0.35%，30～50℃時(shí)蛋白質(zhì)濃度測(cè)定值急劇下降、誤差百分比顯著增加，其中40和50℃孵育30 min后蛋白質(zhì)濃度超出分光光度計(jì)測(cè)定范圍。

2.3 不同溫度處理下50 mg/ml蛋白質(zhì)濃度動(dòng)態(tài)變化 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度為50 mg/ml時(shí)(表3)，在溫度為0℃時(shí)，蛋白質(zhì)濃度測(cè)定值為52.52 μg/ml，與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)濃度比誤差百分比為5.04%。當(dāng)溫度為10℃時(shí)，蛋白質(zhì)濃度測(cè)定值最接近標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度，與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)濃度比誤差為2.02%。當(dāng)溫度為20℃時(shí)，蛋白質(zhì)濃度測(cè)定值升高，與標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度比誤差百分比為3.91%。當(dāng)溫度為30～50℃時(shí)，蛋白質(zhì)濃度測(cè)定值顯著降低，與標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度比誤差百分比在3.98% ～5.09%間波動(dòng)。此外，隨著蛋白質(zhì)與染料孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，0～10℃和30～50℃時(shí)蛋白質(zhì)濃度測(cè)定值顯著下降、誤差百分比顯著增加，其中40和50℃孵育30 min后蛋白質(zhì)濃度超出分光光度計(jì)測(cè)定范圍。20℃時(shí)蛋白質(zhì)濃度測(cè)定值隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng)出現(xiàn)下降，但在孵育30 min時(shí)蛋白質(zhì)濃度測(cè)定值最接近標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度，誤差百分比為0.22%，此后誤差百分比又逐漸升高。

表3 不同溫度對(duì)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定50 mg/ml蛋白質(zhì)濃度的動(dòng)態(tài)影響

2.4 不同溫度處理下75 mg/ml蛋白質(zhì)濃度動(dòng)態(tài)變化 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度為75 mg/ml時(shí)(表4)，在0～50℃溫度時(shí)，蛋白質(zhì)濃度測(cè)定值與標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度比誤差百分比在0.48% ～2.80%間波動(dòng)，其中40℃時(shí)最接近標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度。隨著蛋白質(zhì)與染料孵育時(shí)間延長(zhǎng)，0～10℃和30～50℃時(shí)蛋白質(zhì)濃度測(cè)定值顯著下降、誤差百分比顯著增加，其中40℃孵育30 min和50℃孵育20 min后蛋白質(zhì)濃度超出分光光度計(jì)測(cè)定范圍。20℃時(shí)蛋白質(zhì)濃度測(cè)定值隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng)出現(xiàn)下降，但在孵育20 min時(shí)蛋白質(zhì)濃度測(cè)定值最接近標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度，誤差百分比為1.13%，此后誤差百分比又逐漸升高。

表4 不同溫度對(duì)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定75 mg/ml蛋白質(zhì)濃度的動(dòng)態(tài)影響

2.5 不同溫度處理下100 mg/ml蛋白質(zhì)濃度動(dòng)態(tài)變化 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度為100 mg/ml時(shí)(表5)，在0～50℃溫度時(shí)，蛋白質(zhì)濃度測(cè)定值與標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度比誤差百分比在3.97% ～5.79%間波動(dòng)，其中10℃時(shí)最接近標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度。隨著蛋白質(zhì)與染料孵育時(shí)間延長(zhǎng)，0～10℃和30～50℃時(shí)蛋白質(zhì)濃度測(cè)定值顯著下降、誤差百分比顯著增加，其中40℃孵育30 min和50℃孵育20 min后蛋白質(zhì)濃度超出分光光度計(jì)測(cè)定范圍。20℃時(shí)蛋白質(zhì)濃度測(cè)定值孵育0～20 min間比較穩(wěn)定，孵育30 min時(shí)蛋白質(zhì)濃度測(cè)定值下降但最接近標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度，誤差百分比為2.18%，此后蛋白質(zhì)濃度測(cè)定值和誤差百分比又顯著升高。

表5 不同溫度對(duì)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定100 mg/ml蛋白質(zhì)濃度的動(dòng)態(tài)影響

3 討論

考馬斯亮藍(lán)法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種生物材料的蛋白質(zhì)含量測(cè)定，被眾多科研工作者認(rèn)為是一種傳統(tǒng)的、穩(wěn)定的和可靠的蛋白質(zhì)測(cè)定方法。但該論文研究發(fā)現(xiàn)，溫度、測(cè)定蛋白質(zhì)濃度以及測(cè)定有效時(shí)間等影響因子都決定考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的精度以及后續(xù)蛋白質(zhì)研究的準(zhǔn)確程度。

從溫度變化效應(yīng)來(lái)看，無(wú)論蛋白質(zhì)濃度高低，0～10℃低溫組和30～50℃高溫組考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定的蛋白質(zhì)濃度與標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度比較均有顯著差異，20℃時(shí)測(cè)定的蛋白質(zhì)濃度與標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度比較均差異最小。從蛋白質(zhì)濃度效應(yīng)來(lái)看，在該研究建立的蛋白質(zhì)測(cè)定范圍內(nèi)(0～100 mg/ml)，蛋白質(zhì)濃度較低組(如5 mg/ml)采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定結(jié)果極不穩(wěn)定且誤差率極大，而蛋白質(zhì)濃度越高考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定的蛋白質(zhì)濃度與標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度相比越穩(wěn)定，同時(shí)蛋白質(zhì)濃度越高對(duì)溫度變化引起的影響越小，其中蛋白質(zhì)濃度在25～100 mg/ml各組中，20℃時(shí)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定的蛋白質(zhì)濃度與標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃相比差異最小。從測(cè)定時(shí)間效應(yīng)來(lái)看，在0～10℃低溫組中考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定的蛋白質(zhì)濃度隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng)與標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度比較差異顯著，在30～50℃高溫組中考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定的蛋白質(zhì)濃度隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng)與標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度比較差異極顯著，尤其是在40～50℃高溫時(shí)各濃度蛋白質(zhì)孵育至30～40 min后超出分光光度計(jì)檢測(cè)范圍，但在20℃時(shí)測(cè)定的蛋白質(zhì)濃度在孵育0～30 min過(guò)程中表現(xiàn)穩(wěn)定，尤其是孵育20～30 min后蛋白質(zhì)濃度與標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度比較均差異最小。

通過(guò)對(duì)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的諸多影響因素的研究，得出最優(yōu)化試驗(yàn)方案，在0～100 mg/ml蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定范圍內(nèi)，20℃是考馬斯亮藍(lán)染料最適溫度，因此在測(cè)定蛋白質(zhì)濃度過(guò)程中表現(xiàn)出穩(wěn)定的結(jié)果，但是20℃時(shí)反應(yīng)最佳時(shí)間在孵育20～30 min后才表現(xiàn)出來(lái)，推測(cè)考馬斯亮藍(lán)染料與蛋白質(zhì)結(jié)合需要一定的時(shí)間才能達(dá)到最佳效果。同時(shí)待檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度越高，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度過(guò)程中對(duì)各種因素影響的抵御能力越強(qiáng)，推測(cè)是較高濃度的蛋白質(zhì)對(duì)考馬斯亮藍(lán)染料保護(hù)性較強(qiáng)，對(duì)外界環(huán)境影響具有較好的抵御能力，所以在蛋白質(zhì)濃度測(cè)定中表現(xiàn)出穩(wěn)定的結(jié)果。

綜上所述，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度時(shí)，要注意試驗(yàn)環(huán)境溫度、待測(cè)樣品濃度范圍以及染料與蛋白質(zhì)孵育時(shí)間等互作效應(yīng)，合理優(yōu)化測(cè)定方案，旨在充分利用考馬斯亮藍(lán)法的優(yōu)點(diǎn)準(zhǔn)確測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，為進(jìn)一步研究蛋白質(zhì)性質(zhì)和功能提供科學(xué)依據(jù)。

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