池塘養(yǎng)殖水體與底泥中恩諾沙星降解規(guī)律的初步研究

李邦平 ，孟勇 ，，朱曉華 ，，陳鑫 ，沈美芳 ，，邊文冀

（1.江蘇省淡水水產(chǎn)研究，江蘇 南京 210017；2.江蘇省水產(chǎn)質(zhì)量檢測中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，江蘇 南京 210017）

恩諾沙星為第三代喹諾酮類抗菌藥物，又名乙基環(huán)丙沙星，具有廣譜抗菌活性、具有很強(qiáng)的滲透性，廣泛應(yīng)用于畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域。能與細(xì)菌DNA回旋酶亞基A結(jié)合，從而抑制了酶的切割與連接功能，阻止了細(xì)菌DNA的復(fù)制，呈現(xiàn)出一定的抗菌作用[1]。近幾年來，這類藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中常被作為漁藥和飼料添加劑，用來預(yù)防和治療水產(chǎn)動(dòng)物全身性細(xì)菌感染等疾病[2]。但恩諾沙星會(huì)導(dǎo)致其在水產(chǎn)品的殘留、耐藥性的增強(qiáng)、在養(yǎng)殖環(huán)境中的殘留問題以及通過食物鏈影響到人類健康等方面廣泛引起重視[3]。

目前，國內(nèi)外主要集中于恩諾沙星在鯉魚、歐洲鰻鱺、吉富羅非魚、鰻魚等魚體內(nèi)的藥物代謝規(guī)律的研究[4-7]，但關(guān)于恩諾沙星在漁業(yè)養(yǎng)殖環(huán)境中降解規(guī)律缺少相關(guān)實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為了更加貼切實(shí)際生產(chǎn)情況，走訪了大量鮰魚養(yǎng)殖戶，參考實(shí)際給藥方式和給藥濃度，筆者研究了池塘養(yǎng)殖條件下恩諾沙星及其代謝產(chǎn)物在斑點(diǎn)叉尾體內(nèi)的殘留消除規(guī)律[8]；同時(shí)，針對水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中對使用過恩諾沙星類藥物的養(yǎng)殖環(huán)境進(jìn)行跟蹤檢測。該文旨在探討在養(yǎng)殖環(huán)境（底泥和水體）中恩諾沙星和環(huán)丙沙星降解規(guī)律的初步研究，為水產(chǎn)品的安全性研究與風(fēng)險(xiǎn)評估提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品

試驗(yàn)用恩諾沙星、環(huán)丙沙星及其氘代物(氘代恩諾沙星和氘代環(huán)丙沙星)內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.0%，Dr.Ehrenstorfer）；恩諾沙星原粉（純度≥99.0%，浙江某藥業(yè)進(jìn)出口有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，美國Tedia公司）；乙酸銨、甲酸（色譜純，美國ROE公司）；該實(shí)驗(yàn)用水均來自Millipore純水系統(tǒng)。

1.2 主要儀器

高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀（Qtrap 4500，美國SCIEX公司）；勻漿機(jī)（T18，德國IKA公司）；高速冷凍離心機(jī)（AllegraTM，美國BECKMAN公司）；濃縮工作站（Turbo Vap瑞典Biotage公司）。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品采集

1.4 樣品前處理

量取經(jīng)0.45 μm玻璃纖維濾膜過濾的水樣500 mL，加入 50 μL 的內(nèi)標(biāo)混合液（Enrofloxacin-d5和Ciprofloxacin-d8）以及0.4 g EDTA，在4℃保存。提取之前，再用甲酸調(diào)節(jié)pH值2.0～3.0。然后依次用6 mL甲醇、6 mL去離子水、6 mL磷酸鹽緩沖液（pH=3.0）對HLB固相萃取柱淋洗活化。控制流速3 mL/min左右，將水樣上柱。待過柱完成后，用6 mL去離子水沖洗HLB柱，抽真空5 min，以去除柱中殘留的水分。最后以6 mL甲醇洗脫1次，收集洗脫液，并在室溫下用 N2吹干，用乙腈-0.1%甲酸（2∶8，V/V）混合液定容 1 mL，渦旋震蕩 3～5 min，過 0.22 μm 濾膜，待測。

將采自養(yǎng)殖池塘表層（0～10 cm）的底泥，剔除其中石塊以及植物殘?bào)w，將底泥置于-40℃冷凍干燥一周。研磨干燥過后的土樣，過250 μm孔徑尼龍篩，置于-40℃存放。稱取10 g經(jīng)研磨過后的土樣于50 mL離心管中，加入50 μL的內(nèi)標(biāo)混合液和0.4 g EDTA，以及混合提取液20 mL（磷酸鹽緩沖液（pH=3.0）-乙腈，1∶1，V/V），渦旋 5 min，4 ℃下 5 000 r/min離心15 min，收集上層提取液。反復(fù)提取1次，合并提取液并混勻。在室溫下用N2吹至總體積小于20 mL，用去離子水稀釋到100 mL，用甲酸調(diào)節(jié)pH值2.8～3.0。用SAX-HLB串聯(lián)固相萃取柱凈化與富集，過柱完成后，除去SAX柱，用6 mL去離子水沖洗HLB柱，抽真空5 min，以去除柱中殘留的水分。最后以6 mL甲醇洗脫1次，收集洗脫液，并在室溫下用 N2吹干，用乙腈-0.1%甲酸（2∶8，V/V）混合液定容 1 mL，渦旋震蕩 3～5 min，過 0.22 μm 濾膜，待測。

1.5 試驗(yàn)分析與結(jié)果處理

色譜條件和質(zhì)譜條件見孟勇等[8]方法，數(shù)據(jù)處理利用內(nèi)標(biāo)法（氘代恩諾沙星和氘代環(huán)丙沙星為內(nèi)標(biāo)物）計(jì)算含量，采用SigmaPlot 11.0軟件處理進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法驗(yàn)證結(jié)果

根據(jù)圖1顯示結(jié)果，恩諾沙星和環(huán)丙沙星在質(zhì)控樣品和底泥中的殘留有較好的檢出峰形,空白對照組未出現(xiàn)檢出峰，且內(nèi)標(biāo)物氘代恩諾沙星和氘代環(huán)丙沙星峰形良好。檢測限濃度為1 ng/mL，依據(jù)內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，利用SAX-HLB串聯(lián)固相萃取柱達(dá)到凈化與富集的效果，可以很好避免水體和底泥中非目標(biāo)化合物的干擾，檢測濃度準(zhǔn)確可靠，可以很好避免檢測過程中出現(xiàn)過多的目標(biāo)物損失，以致試驗(yàn)失敗。

在加標(biāo)水平1.0～10.0 μg/kg時(shí)，所得到的恩諾沙星和環(huán)丙沙星的平均回收率均大于80%，精密度小于10%。在空白樣品中添加恩諾沙星和環(huán)丙沙星，信噪比（S/N）為3時(shí)計(jì)算檢測限（LOD），信噪比（S/N）為10時(shí)計(jì)算定量限（LOQ）。結(jié)果表明該方法能夠滿足檢測殘留分析的要求，具體結(jié)果見表1。

表1 不同環(huán)境樣品的回收率

2.2 池塘水體中恩諾沙星的降解分析

圖2顯示恩諾沙星在養(yǎng)殖水體中的殘留情況。結(jié)果表明，在連續(xù)投喂5 d拌有恩諾沙星的飼料后，養(yǎng)殖水體中恩諾沙星在第5天出現(xiàn)峰值分別為：在高劑量投喂水平下是738.9 ng/L，在低劑量投喂水平下是621.7 ng/L，在喂藥結(jié)束后開始下降，持續(xù)到第29天，29 d后高劑量組達(dá)到最低值16.2 ng/L，低劑量組9.3 ng/L。第29天后水體中恩諾沙星含量達(dá)到平衡。而水體中未檢測到環(huán)丙沙星的變化。

2.3 池塘底泥中恩諾沙星及其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星的降解分析

圖3顯示恩諾沙星及其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星在養(yǎng)殖底泥中的殘留情況。結(jié)果顯示，恩諾沙星在第7天出現(xiàn)峰值，在高劑量投喂水平下是228.5 ng/g，在低劑量投喂水平下是135.6 ng/g；第11天開始下降，持續(xù)到第29天，29 d后高劑量組達(dá)到最低值18.6 ng/g，低劑量組7.3 ng/g；其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星出現(xiàn)峰值也是在第7天，高劑量投喂水平下是23.3ng/g，低劑量投喂水平下是9.0 ng/g，第11天開始下降，持續(xù)到第29天，29 d后高劑量組達(dá)到最低值4.4 ng/g，低劑量組2.9 ng/L。第29天開始底泥中恩諾沙星和環(huán)丙沙星含量達(dá)到平衡。

3 討論

3.1 池塘水體中恩諾沙星的消除規(guī)律分析

連續(xù)5 d投喂帶有恩諾沙星的飼料后，水體中恩諾沙星在第5天出現(xiàn)峰值，第7天開始下降，持續(xù)到第29天。第29天后水體中恩諾沙星含量達(dá)到平衡。有報(bào)道稱，池塘養(yǎng)殖模式下投喂的飼料有5%～10%的未被魚類食用，而被食用消化的飼料中又會(huì)有25%～30%的以糞便形式排出體外，剩餌、糞便的累積都會(huì)導(dǎo)致水體里藥物殘留。未被魚類食用，以及殘?jiān)?、糞便都會(huì)使水體里恩諾沙星的含量增高[9,10]。相關(guān)報(bào)道稱，恩諾沙星進(jìn)入水體后，會(huì)被壞境沉積物所吸附，較長時(shí)間不被分解反復(fù)經(jīng)過解析作用從而導(dǎo)致其長時(shí)間不被消除[11-12]。連續(xù)5 d的給藥時(shí)間，在第5天出現(xiàn)峰值，第7天開始消耗累積的藥物，持續(xù)到第29天，之后較長一段時(shí)間表現(xiàn)出的是環(huán)境的動(dòng)態(tài)平衡。楊秋紅等[13]在研究斑點(diǎn)叉尾在不同溫度下對恩諾沙星代謝規(guī)律發(fā)現(xiàn)，在120 d后肌肉中恩諾沙星含量是0.012 mg/kg和0.001 mg/kg。孟勇等[8]在池塘養(yǎng)殖條件下恩諾沙星及其代謝產(chǎn)物在斑點(diǎn)叉尾體內(nèi)的殘留消除規(guī)律中提到，兩種劑量投喂模式下，在138 d后肌肉中恩諾沙星含量是0.013 mg/kg和0.019 mg/kg。李娜[14]在恩諾沙星在養(yǎng)殖大菱鲆體內(nèi)的殘留及消除規(guī)律的研究中發(fā)現(xiàn)，94 d后肌肉組織中恩諾沙星的含量為0.168 mg/kg。對比發(fā)現(xiàn)恩諾沙星的殘留在水產(chǎn)品組織內(nèi)很難被清除，這很可能與水體中殘留有關(guān)。恩諾沙星在不同生物體內(nèi)代謝產(chǎn)物種類及含量存在差異，吳寶銀[15]關(guān)于恩諾沙星水解特性的研究發(fā)現(xiàn)，恩諾沙星在水體中不能被代謝為環(huán)丙沙星。Tiefenbacher[16]研究表明，環(huán)丙沙星光解時(shí)會(huì)產(chǎn)生一種二聚合物。Hudrea[17]進(jìn)一步闡明了環(huán)丙沙星的光解產(chǎn)物為乙二胺基化合物。對比該試驗(yàn)結(jié)果，恩諾沙星在進(jìn)入水體后，未檢測到環(huán)丙沙星的變化，可能與其光解有關(guān)。而恩諾沙星在水體中存在時(shí)間較長，藥物劑量和殘留量存在一定的相關(guān)關(guān)系，劑量越大會(huì)加大殘留量。

3.2 池塘底泥中恩諾沙星及其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星消除規(guī)律分析

連續(xù)5 d投喂帶有恩諾沙星的飼料后，底泥中檢測出環(huán)丙沙星的存在，在第7天出現(xiàn)峰值，第11天開始下降，持續(xù)到第29天。第29天后底泥中恩諾沙星和環(huán)丙沙星含量達(dá)到平衡。底泥中恩諾沙星出現(xiàn)峰值比水體中要晚，可能與魚類排泄以及底泥的吸附有關(guān)。劉永開在關(guān)于恩諾沙星在水產(chǎn)中的應(yīng)用和研究中，報(bào)道了當(dāng)恩諾沙星進(jìn)入水體后，會(huì)被水環(huán)境中的沉積物所吸附，且水體里消失恩諾沙星有約65%的進(jìn)入淤泥。所以進(jìn)入淤泥的恩諾沙星保持較長時(shí)間不被分解，反復(fù)經(jīng)過解析作用向水體中釋放[18]。王富民等[12]報(bào)道了恩諾沙星和環(huán)丙沙星在湖庫底泥和土壤中的吸附與解析特性的研究，水體中N、P含量的變化，對底泥和土壤對CIP和ENR的吸附/解吸過程有不同影響。吳銀寶[11]在對土壤對恩諾沙星的吸附和解吸特性研究中發(fā)現(xiàn)，土壤對恩諾沙星的吸附性很強(qiáng)，吸附量占水相中恩諾沙星總量的99%以上，其解析量僅為吸附量的1‰左右。這很有可能解釋土壤對恩諾沙星和環(huán)丙沙星的吸附導(dǎo)致其出現(xiàn)峰值時(shí)間要比水體中出現(xiàn)峰值要晚的原因。對比水體中恩諾沙星消除規(guī)律發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖環(huán)境維持在29 d以上，水體中和底泥中恩諾沙星的殘留量達(dá)到環(huán)境平衡時(shí)，其含量維持在較小范圍的浮動(dòng)變化，說明恩諾沙星在底泥和水體中存在一定的反復(fù)吸附和解析的過程，且呈現(xiàn)平衡狀態(tài)。張春艷等[19]研究發(fā)現(xiàn)，底泥對恩諾沙星的吸附性很強(qiáng)，且環(huán)丙沙星在底泥中的降解相當(dāng)緩慢，結(jié)果與該文相一致。

3.3 養(yǎng)殖環(huán)境中恩諾沙星及其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星對生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的評估

環(huán)境中藥物殘留消除規(guī)律的研究對水產(chǎn)品質(zhì)量安全有重要的參考價(jià)值。董玉瑛[20]在對水體中鹽酸環(huán)丙沙星的風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)分析中提出，在沿海養(yǎng)殖區(qū)的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)甚至高于污水處理廠排水。吳寶銀在對恩諾沙星在雞糞中的殘留及其生態(tài)毒理學(xué)研究中指出，恩諾沙星不僅會(huì)在畜禽產(chǎn)品中殘留，其活性代謝物還會(huì)隨著排泄物進(jìn)入生態(tài)，對生態(tài)造成影響。楊彎彎等[21]在研究恩諾沙星對銅綠微囊藻的毒性研究中，發(fā)現(xiàn)恩諾沙星能夠阻礙銅綠微囊藻的光合作用，抑制其可溶性蛋白的合成。馬驛[22]的研究發(fā)現(xiàn)環(huán)丙沙星對土壤微生物量碳含量影響顯著（P＜0.05），土壤中環(huán)丙沙星濃度愈高，微生物量碳含量愈低，100 μg/g的環(huán)丙沙星處理使土壤微生物量碳含量下降58.69%。環(huán)丙沙星對土壤微生物群落碳代謝功能影響顯著，環(huán)丙沙星降低了土壤微生物對碳水化合物、羧酸、氨基酸、聚合物、酚類和胺類的碳源利用率。關(guān)注養(yǎng)殖環(huán)境中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的殘留量，是水產(chǎn)養(yǎng)殖關(guān)鍵之所在。要想養(yǎng)好魚，就要有好的水質(zhì)和底泥環(huán)境。美國FDA組織對恩諾沙星類藥物做了強(qiáng)烈性限制，規(guī)定魚、貝類水產(chǎn)品中對恩諾沙星和環(huán)丙沙星不得有檢出[23]。因此，在養(yǎng)殖出口魚類、貝類養(yǎng)殖過程中要注意養(yǎng)殖環(huán)境的選擇。在該試驗(yàn)的重點(diǎn)研究了養(yǎng)殖水體和底泥中恩諾沙星環(huán)境中的代謝及殘留分析。試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了，在關(guān)注產(chǎn)品的同時(shí)，也不可忽視對水產(chǎn)品養(yǎng)殖環(huán)境的改善，解決措施定期清底曝曬和換水，改善養(yǎng)殖環(huán)境。