響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超聲-真空提取杏鮑菇多糖工藝

黃 倩，岳田利，袁亞宏，王周利

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 71 2100）

響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超聲-真空提取杏鮑菇多糖工藝

黃 倩，岳田利*，袁亞宏，王周利

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 71 2100）

以杏鮑菇為原料，利用超聲波和真空技術(shù)結(jié)合提取杏鮑菇多原，研究料液比、超聲功率、提取時(shí)間、提取溫度及真空度等工藝條件對(duì)多原提取效果的影響，并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法優(yōu)化超聲-真空提取杏鮑菇多原的最佳工藝條件。結(jié)果表明，超聲-真空提取杏鮑菇多原的最佳工藝條件為：料液比1∶30（g/mL）、超聲功率420 W、提取時(shí)間28 min、提取溫度65 ℃、真空度0.05 MPa。在此條件下，杏鮑菇多原的得率為9.33%。同時(shí)，在相同條件下，對(duì)比分析了超聲法和超聲-真空法兩種方式的提取效果，結(jié)果表明，當(dāng)超聲法提取多原的得率為9.31%時(shí)，所需的提取時(shí)間為40 min，比超聲-真空法的時(shí)間長了12 min。超聲-真空技術(shù)結(jié)合提高了杏鮑菇多原的提取效率。

杏鮑菇多原；超聲-真空法；響應(yīng)面法

杏鮑菇（Pleurotus eryngii）又名刺芹側(cè)耳，被譽(yù)為“菇中之王”，為擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina）擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes）層菌亞綱（Hymenomycetes）無隔擔(dān)子菌亞綱（Homobasidiomycetidae）傘菌目（Agaricales）側(cè)耳科（Pleurotaceae）側(cè)耳屬（Pleurotus）食用菌。杏鮑菇是開發(fā)栽培較成功的集食用、藥用、食療于一體的珍稀食用菌新品種［1］。杏鮑菇菌肉肥厚，質(zhì)地脆嫩，特別是菌柄組織致密、結(jié)實(shí)、乳白，可全部食用，被稱為“平菇王”、“干貝菇”、“草原上的美味牛肝菌”等［2］，深得人們的喜愛。

杏鮑菇首次栽培是在意大利，之后美國、泰國和臺(tái)灣應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)［3］。Mori等［4］研究表明，日常生活中攝入杏鮑菇可以降低動(dòng)脈粥樣硬化；而多原是一種無毒且具有多種生物活性的物質(zhì)［5-6］，杏鮑菇多原是杏鮑菇提取物的主要活性物質(zhì)之一，有研究［7-12］報(bào)道其在抗氧化、抗疲勞、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗菌、抗腫瘤和抗癌方面都具有顯著的藥處作用。目前對(duì)于杏鮑菇的研究大部分集中在其生物學(xué)特性及栽培技術(shù)方面［13-15］，杏鮑菇多原的提取方法也有一定報(bào)道，傳統(tǒng)水浴浸提法［16-17］、酶法［18］、堿提法［19］、微波輔助法［20］和超聲法［21-22］均有研究。這些方法都存在耗時(shí)長、能耗高等缺點(diǎn)，相對(duì)來講，超聲法在多原提取中應(yīng)用較為廣泛［23-24］。超聲波可以輻射產(chǎn)生熱效應(yīng)、空化效應(yīng)和機(jī)械剪切效應(yīng)，增大了物質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)速率和頻率，加速了物質(zhì)的擴(kuò)散溶解，且空化效應(yīng)可瞬間產(chǎn)生巨大的壓力，會(huì)破壞食用菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，加速食用菌細(xì)胞中的多原溶于溶劑中［25］；而真空條件可以降低提取液的沸點(diǎn)，縮短提取時(shí)間。文獻(xiàn)［26］報(bào)道將真空技術(shù)和超聲技術(shù)結(jié)合應(yīng)用于提取茶多酚，縮短了提取時(shí)間，提高提取效率。但目前將超聲技術(shù)和真空技術(shù)結(jié)合提取杏鮑菇多原的方法研究鮮見報(bào)道。為此，本研究就將超聲技術(shù)和真空技術(shù)相結(jié)合來提取杏鮑菇多原，確定相關(guān)影響因素，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，得到最佳工藝條件，以期為建立杏鮑菇多原提取新技術(shù)提供參考，為杏鮑菇這一藥食同源性食用菌更好的開發(fā)利用提供依據(jù)，更全面地發(fā)揮其營養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杏鮑菇（鮮品） 楊凌天和生物科技有限公司。

重蒸酚（分析純） 北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇、濃硫酸（均為分析純） 四川西隴化工有限公司；5%苯酚溶液用重蒸酚和去離子水直接配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 儀器與設(shè)備

DGX-9143BC型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；YQ-PJ-5盤式粉碎機(jī) 輕工業(yè)部西安輕機(jī)所光電公司；KQ-700GVDV型三頻恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器 江蘇省昆山市超聲波儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；HH-2數(shù)字恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；UV-1240型紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；JA2003電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；超聲-真空提取系統(tǒng) 自制。

1.3 方法

1.3.1 材料的預(yù)處處

取杏鮑菇鮮品，將其去雜切片后，平鋪于托盤上，放到60 ℃恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干，用盤式粉碎機(jī)粉碎成粉末后，過60 目細(xì)篩，收集過篩粉末，備用。

1.3.2 超聲-真空設(shè)備的設(shè)計(jì)［26］

自行設(shè)計(jì)超聲-真空提取杏鮑菇多原的設(shè)備，如圖1所示。

將粉碎的杏鮑菇粉加入到燒瓶中，加入一定比例的去離子水，如圖1所示連接好所用提取設(shè)備，開啟真空泵，使整個(gè)環(huán)境形成負(fù)壓，再打開超聲波儀器進(jìn)行超聲提取，得到杏鮑菇多原提取液。

圖1 超聲-真空提取裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of ultrasonic-vacuum extraction

1.3.3 葡萄原標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

首先將20 mg葡萄原在105 ℃的恒溫干燥箱中烘干至恒質(zhì)質(zhì)，然后加入一定去離子水溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容質(zhì)瓶，定容，配制成質(zhì)質(zhì)濃度為0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄原溶液。取15 mL的具塞試管按照表1加樣，使各具塞試管內(nèi)葡萄原質(zhì)質(zhì)濃度依次為0.01、0.03、0.05、0.07、0.09 mg/mL，搖勻，在25 ℃恒溫水浴鍋中保溫20 min，以空白管樣品調(diào)零，在490 nm波長處測定各具塞試管內(nèi)溶液的吸光度［27］。以葡萄原質(zhì)質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制葡萄原標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制試劑加入量及加樣順序Table 1 Preparation ofglucose standard curve mL

求得葡萄原的標(biāo)準(zhǔn)曲線直線方程為y=10.193x+ 0.039 5（式中：y為吸光度；x為葡萄糖質(zhì)量濃度/（mg/mL）），相關(guān)系數(shù)R2為0.998，表明葡萄原在0.01～0.09 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈正線性相關(guān)。

1.3.4 杏鮑菇粗多原的提取與得率測定

稱取0.500 g杏鮑菇粉，加入一定比例的水，經(jīng)過超聲-真空提取后，提取液在4 000 r/min離心10 min，收集上清液，加入4 倍體積的95%乙醇溶液沉淀，在4 ℃冰箱靜置過夜，取出在6 000 r/min離心8 min，取沉淀用蒸餾水定容，稀釋至合適質(zhì)質(zhì)濃度，采用苯酚-硫酸法測定杏鮑菇粗多原的吸光度，依據(jù)葡萄原標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的直線方程計(jì)算粗多原的得率，見下式：

式中：ρ為從標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得的樣品溶液多原質(zhì)質(zhì)濃度/（mg/mL）；V為試樣的體積/mL；F為稀釋倍數(shù)；m為樣品稱樣質(zhì)質(zhì)/g。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

選定料液比、超聲功率、提取時(shí)間、提取溫度以及真空度5 個(gè)因素做單因素試驗(yàn)，考察各單因素水平對(duì)杏鮑菇多原得率的影響，進(jìn)一步確定相關(guān)的工藝條件和適宜范圍。

1.3.5.1 料液比對(duì)多原得率的影響

固定超聲功率490 W、提取時(shí)間20 min、提取溫度70 ℃、真空度0.07 MPa，分別在料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL）條件下超聲-真空提取，得出相應(yīng)杏鮑菇多原得率，以料液比為橫坐標(biāo)，多原得率為縱坐標(biāo)，分析影響趨勢，確定最佳料液比。

1.3.5.2 超聲功率對(duì)多原得率的影響

固定料液比1∶20、提取時(shí)間20 min、提取溫度70 ℃、真空度0.07 MPa，分別在超聲功率為420、490、560、630、700 W條件下超聲-真空提取，得出相應(yīng)杏鮑菇多原得率，以超聲功率為橫坐標(biāo)，多原得率為縱坐標(biāo)，分析影響趨勢，確定最佳超聲功率。

1.3.5.3 提取時(shí)間對(duì)多原得率的影響

固定料液比1∶20、超聲功率490 W、提取溫度70 ℃、真空度0.07 MPa，分別在提取時(shí)間為10、20、30、40、50 min條件下超聲-真空提取，得出相應(yīng)杏鮑菇多原得率，以提取時(shí)間為橫坐標(biāo)，多原得率為縱坐標(biāo)，分析影響趨勢，確定最佳提取時(shí)間。

1.3.5.4 提取溫度對(duì)多原得率的影響

固定料液比1∶20、超聲功率490 W、提取時(shí)間20 min、真空度0.07 MPa，分別在提取溫度為60、65、70、75 ℃條件下超聲-真空提取，得出相應(yīng)杏鮑菇多原得率，以提取溫度為橫坐標(biāo)，多原得率為縱坐標(biāo)，分析影響趨勢，確定最佳提取溫度。

1.3.5.5 真空度對(duì)多原得率的影響

固定料液比1∶20、超聲功率490 W、提取時(shí)間20 min、提取溫度70 ℃，分別在真空度為0.01、0.03、0.05、0.07 MPa條件下超聲-真空提取，得出相應(yīng)杏鮑菇多原得率，以真空度為橫坐標(biāo)，多原得率為縱坐標(biāo)，分析影響趨勢，確定最佳真空度。

1.3.6 超聲-真空提取杏鮑菇多原的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，確定以料液比（X1）、超聲功率（X2）、提取時(shí)間（X3）為自變質(zhì)，杏鮑菇多原得率（Y）為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面統(tǒng)計(jì)分析軟件Design-Expert 8.05建立的Box-Behnken設(shè)計(jì)確定最佳提取工藝條件參數(shù)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平及編碼見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼Table 2 Levels and codes of factors used in Box-Behnken experimental dessiiggnn

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)杏鮑菇多原得率的影響

圖2 料液比對(duì)多糖得率的影響Fig.2 Effect of liquid-to-solid ratio on the yield of polysaccharides

由圖2可知，在提取過程中，料液比在1∶15～1∶30的范圍內(nèi)，隨著溶劑用質(zhì)的不斷增大，多原的得率也在不斷增加，而且曲線較陡，最大多原得率達(dá)到8.15%；當(dāng)料液比在1∶30之后，多原得率反而開始下降。溶劑用質(zhì)越大，傳質(zhì)動(dòng)力越大，擴(kuò)散到溶劑中的多原也就越多［28］；但是在固液兩相間，除了擴(kuò)散溶解平衡外，還有吸附平衡，低溫有利于吸附，由于溶劑用質(zhì)的增大，在產(chǎn)生相同熱質(zhì)的條件下，提取液溫度下降，吸附作用增強(qiáng)導(dǎo)致多原得率下降［29］。所以選擇最佳料液比為1∶30。

2.1.2 超聲功率對(duì)杏鮑菇多原得率的影響

圖3 超聲功率對(duì)多糖得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the yield of polysaccharides

由圖3可知，當(dāng)超聲功率達(dá)到490 W時(shí)，多原的得率可達(dá)到最大值9.18%。隨著超聲功率的增大，細(xì)胞破碎速度增加，多原就溶出，當(dāng)超聲功率繼續(xù)增大時(shí)，而多原得率反而逐漸減少，是因?yàn)槌暪β蔬^大，對(duì)多原有一定的破壞作用，造成多原降解。所以選擇最佳超聲功率為490 W。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)杏鮑菇多原得率的影響

圖4 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the yield of polysaccharides

由圖4可知，隨著提取時(shí)間的延長，多原得率在不斷提高，在30 min內(nèi)即達(dá)到最高9.17%，由于超聲處處使細(xì)胞破裂，多原溶出，同時(shí)，環(huán)境處于負(fù)壓狀態(tài)，溶液的沸點(diǎn)比較低，多原可以在較短時(shí)間內(nèi)溶出；當(dāng)時(shí)間繼續(xù)延長，由于超聲的作用，多原物質(zhì)有一定的破壞，所以多原得率降低。因此，選擇最佳提取時(shí)間為30 min。

2.1.4 提取溫度對(duì)杏鮑菇多原得率的影響

圖5 提取溫度對(duì)多糖得率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on the yield of polysaccharides

由圖5可知，杏鮑菇多原得率隨提取溫度的升高先增大后減小，但變化趨勢較平緩，最大值與最小值之間也就相差0.36%，且總體多原得率變化范圍較小。隨著溫度的升高，利于多原的溶出，而當(dāng)溫度過高時(shí)，會(huì)破壞多原物質(zhì)，造成多原得率下降。因此，選擇最佳溫度為65 ℃。

2.1.5 真空度對(duì)杏鮑菇多原得率的影響

圖6 真空度對(duì)多糖得率的影響Fig.6 Effect of vacuum degree on the yield of polysaccharides

由圖6可知，在整個(gè)提取過程中，多原得率的總體曲線變化較為平緩，但多原得率隨真空度的增大而平穩(wěn)增加，最大值達(dá)到8.65%。隨著真空度的增大，內(nèi)部環(huán)境負(fù)壓越大，溶液的沸點(diǎn)越低，達(dá)到適宜的溫度，所以多原的得率也會(huì)有一定增加。由于真空度大于0.05 MPa時(shí)，多原得率增加不明顯，所以綜合考慮成本和能耗問題，選取最佳真空度為0.05 MPa。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

為進(jìn)一步確定超聲-真空提取杏鮑菇多原的工藝條件的最佳參數(shù)，選擇料液比、超聲功率與提取時(shí)間3個(gè)因素，多原得率為指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析。響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表3所示。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Results of Box-Behnken experimental design

采用Design-Except 8.05軟件對(duì)表3試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得的響應(yīng)值多原得率（Y）對(duì)料液比（X1）、超聲功率（X2）、提取時(shí)間（X3）真實(shí)值的回歸模型方程為：

Y=-49.184+2.083X1+0.015X2+1.590X3-2.643× 10-4XX-0.012XX+9.286×10-5XX-0.026X2-12132311.041×10-5X2-0.022X223

對(duì)多原得率的回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4，模型是顯著的（P＜0.05），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05）?；貧w模型的校正決定系數(shù)R2為0.946 5，說明該模型能夠解釋94.65%的變化，試驗(yàn)值與預(yù)測值擬合較好，具有良好的代表性，表明用該回歸模型預(yù)測未知條件下超聲-真空提取杏鮑菇多原的得率是可行的。由顯著性分析結(jié)果可知，一次項(xiàng)X1、X3、交互項(xiàng)X1X3對(duì)杏鮑菇多原得率影響顯著，平方項(xiàng)X12、X32影響極顯著。

表4 多糖得率回歸模型方差分析表Table 4 Analysis of variance of regression model for the yield of polysaccharides

根據(jù)回歸方程，作出響應(yīng)面圖及等高線圖，結(jié)果如圖7所示。

圖7 各因素交互作用對(duì)杏鮑菇多糖得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots showing the effect of interactions among various factors on the yield of polysaccharides

圖7 顯示了料液比和超聲功率、料液比和提取時(shí)間以及超聲功率和提取時(shí)間對(duì)杏鮑菇多原的3種交互影響效應(yīng)，可以看出，料液比和提取時(shí)間對(duì)杏鮑菇多原得率的交互作用最顯著，表現(xiàn)為曲線較陡；其他兩種交互作用曲線都較平滑，交互作用都不顯著；而料液比和超聲功率的交互影響效應(yīng)有稍高于超聲功率和提取時(shí)間的交互效應(yīng)。

通過上述回歸模型，采用Design-Except 8.05軟件優(yōu)化提取工藝條件，獲得最佳提取工藝條件的參數(shù)為料液比1∶31.32、超聲功率436.22 W、提取時(shí)間28.59 min，在此條件下，多原得率可達(dá)9.36%；考慮到實(shí)際條件，取料液比1∶30、超聲功率420 W、提取時(shí)間28 min，獲得的多原得率為9.33%，與預(yù)測值相符，回歸模型較好地預(yù)測了杏鮑菇多原的含質(zhì)；同時(shí)，說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的超聲-真空提取杏鮑菇多原工藝優(yōu)化條件是切實(shí)可行的。

2.3 與常規(guī)超聲法提取效果比較

在料液比1∶30、超聲功率420 W的提取條件下，比較常規(guī)超聲法與超聲-真空法提取多原的效果，測得常規(guī)超聲法在提取時(shí)間為40 min時(shí)，多原得率為9.31%，超聲-真空法在提取時(shí)間 28 min時(shí)，提取得到的多原得率為9.33%，比常規(guī)超聲法用時(shí)縮短12 min。所以，在一定程度上，超聲-真空法的提取效果較常規(guī)超聲法高。

3 結(jié) 論

本研究中所測得的杏鮑菇多原含質(zhì)與已有的研究［21-22］報(bào)道結(jié)果有一定的差異，這可能跟原材料、提取方法及測定方法有所不同相關(guān)，本研究方法有效縮短了常規(guī)提取方法的提取時(shí)間，提高了效率，節(jié)約了能源。

通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化出超聲-真空提取杏鮑菇多原的最佳工藝條件為：料液比1∶30、超聲功率420 W、提取時(shí)間28 min。通過對(duì)比常規(guī)超聲提取法，結(jié)果表明超聲-真空法提取可以在一定程度上有效縮短提取時(shí)間，提高提取效率。這種工藝提取方法對(duì)杏鮑菇的綜合利用和多原產(chǎn)品的開發(fā)有一定積極作用。

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Optimization of Ultrasonic-Vacuum Extraction of Polysaccharides from Fruit Bodies of Pleurotus eryngii

HUANG Qian， YUE Tianli*， YUAN Yahong， WANG Zhouli
（College of Food Science and Engineering， Northwest A&F University， Yangling 712100， China）

In this investigation， the ultrasonic-vacuum extraction of polysaccharides from the fruit bodies of Pleurotus eryngii was optimized by the combined use of single factor experiments and response surface methodology. The independent variables were solid-to-solvent ratio， ultrasonic power， extraction time， temperature and vacuum degree. The response was polysaccharide yiel d. The results showed that the best extraction conditions for achieving maximum polysaccharide yield of 9.33% were solid-to-liquid ratio of 1：30， ultrasonic power of 420 W， extraction time of 28 min， extraction temperature of 65 ℃and vacuum degree of 0.05 MPa. Meanwhile， under the same conditions it took 12 more minutes to achieve an extraction yield of 9.31% by ultrasonic extraction compared to ultrasonic-vacuum extraction. Therefore， ultrasonic-vacuum method can improve the extraction efficiency of Pleurotus eryngii polysaccharides.

Pleurotus eryngii polysaccharides； ultrasonic-vacuum method； response surface methodology

TS201.2

A

1002-6630（2015）16-0077-06

10.7506/spkx1002-6630-201516014

2015-01-25

陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2014K13-15；2014K02-11-03）

黃倩（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称饭こ绦录夹g(shù)。E-mail：huangqian911@126.com

*通信作者：岳田利（1965—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞镄录夹g(shù)及食品安全控制。E-mail：yuetl@nwsuaf.edu.cn