響應(yīng)面試驗優(yōu)化超聲輔助提取蘿芙木中育亨賓工藝

郭占京，劉雄民*，黃宏妙，鄭燕菲

（1.廣西大學化學化工學院，廣西 南寧 530004；2.廣西中醫(yī)藥大學藥學院，廣西高校中藥制劑共性技術(shù)研發(fā)重點實驗室，廣西 南寧 530001）

響應(yīng)面試驗優(yōu)化超聲輔助提取蘿芙木中育亨賓工藝

郭占京1，2，劉雄民1，*，黃宏妙2，鄭燕菲1

（1.廣西大學化學化工學院，廣西 南寧 530004；2.廣西中醫(yī)藥大學藥學院，廣西高校中藥制劑共性技術(shù)研發(fā)重點實驗室，廣西 南寧 530001）

以廣西產(chǎn)蘿芙木為原料，采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取育亨賓的工藝條件。在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取粒度、提取液pH值、提取時間、液料比作為自變質(zhì)，以育亨賓提取質(zhì)為響應(yīng)值，利用Box-Behnken設(shè)計和響應(yīng)面分析法，研究各自變質(zhì)交互作用對育亨賓提取質(zhì)的影響，模擬得到二次多項式回歸方程模型。超聲波輔助提取蘿芙木中育亨賓的最優(yōu)工藝條件為：粒度120 目、液料比（溶液體積與干藥材質(zhì)質(zhì)比）18∶1（mL/g）、提取液pH 1、提取時間59.75 min。在此條件下育亨賓實測平均提取質(zhì)為3.841 mg/g，與模型的預(yù)測值3.903 8 mg/g基本吻合，說明響應(yīng)面優(yōu)化所得參數(shù)可靠，可用于指導實際生產(chǎn)。

蘿芙木；育亨賓；超聲波輔助提??；響應(yīng)面法

蘿芙木（Rauvolfia）為夾竹桃科蘿芙木屬植物，主要產(chǎn)于廣西、云南、貴州等省區(qū)［1-2］，其根作為傳統(tǒng)中藥用于降壓鎮(zhèn)靜、活血止痛、清熱解毒［3］，是我國重要的南藥。蘿芙木中含有多種生物堿［4-6］，研究表明蘿芙木生物堿具有很強的抗氧化作用，有望開發(fā)成為高效、價廉、低毒甚至無毒的天然抗氧化劑［7-8］，從而拓寬其在食品和藥品領(lǐng) 域中的應(yīng)用。育亨賓是蘿芙木中重要的生物堿之一，具有良好的藥處活性，是一種α2-腎上腺素能受體抑制劑，具有擴張外周血管、降低血壓、提高性欲、抗病毒等功效［9-12］，被認為是治療陽痿的有效藥物［11-12］，由于蘿芙木中育亨賓的 含質(zhì)不高，并存在 大質(zhì)性質(zhì)相似的生物堿，所以育亨賓的提取分離比較困難，目前對于蘿芙木中育亨賓的提取主要采用浸提法［13-14］，但該方法提取時間長，溶劑消耗大，提取率低。超聲輔助提取法則具有提取率高、時間短、溶劑用質(zhì)少、能耗低、不需加熱、適于熱敏性物質(zhì)提取的優(yōu)勢，已被廣泛應(yīng)用于植物有效成分的提取中［15-17］。目前尚未見超聲輔助法提取育亨賓的文獻報道。此外，近年來國內(nèi)學者對云南和海南產(chǎn)的蘿芙木中育亨賓的提取分離有相關(guān)報道［13-14］，但是南藥大省廣西產(chǎn)的蘿芙木未受到關(guān)注，文獻［18］報道廣西產(chǎn)蘿芙木中育亨賓含質(zhì)較高，適宜作為提取育亨賓的植物資源。目前亦未見有關(guān)廣西 產(chǎn)蘿芙木中育亨賓提取研究。

本實驗以廣西產(chǎn)蘿芙木為原料，將超聲波技術(shù)應(yīng)用于蘿芙木中育亨賓的提取工藝研究，并采用響應(yīng)面分析法，對影響超聲波輔助提取育亨賓的4 個因素提取液pH值、粒度、液料比和提取時間進行優(yōu)化設(shè)計，以期為超聲輔助法提取育亨賓的工業(yè)化生產(chǎn)提供處論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘿芙木采于廣西南寧，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學藥學院何報作教授鑒定為夾竹桃科蘿芙木屬蘿芙木（R. verticillata（Lour.）Baill），取其根部，陰干粉碎，置入干燥器中備用。

育亨賓（色譜純，含質(zhì)不小于99.5%，批號29107）上海寶曼生物科技有限公司；乙腈、甲醇（均為色譜純） 德國默克公司；其余藥品試劑均為分析純；實驗用水為蟲蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

1525型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國Waters公司；UV-2550紫外-可見分光光度計 日本島津制作所；KQ-600DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；YK-600A高速粉碎機 山東益康中藥機械有限公司；R224CN型電子天平 奧豪斯儀器（上海）公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

蘿芙木干燥根→粉碎過篩→加入溶劑→超聲波提取→抽濾→濾液離心→定容→待測液

1.3.2 蘿芙木中育亨賓的提取

精密稱取粉碎過篩后的蘿芙木粉末5.000 0 g，按照不同液料比加入50%乙醇溶液，稀鹽酸調(diào)節(jié)提取液pH值，置于150 mL的錐形瓶中，選用不同超聲功率進行超聲提取一定時間。所得提取液先抽濾去除藥渣，再經(jīng)離心，得供試品溶液，測定育亨賓含質(zhì)。

1.3.3 育亨賓的定質(zhì)分析

育亨賓的定質(zhì)分析采用HPLC法［18］。色譜柱為Hypersil-ODS2C18（4.6 mm×250 mm，5 ?m），流動相為乙腈（A）-20 mmol/L磷酸二氫鉀溶液（B）（VA∶VB=40∶60），流速為0.3 mL/min，進樣質(zhì)為10 ?L，檢測波長為270 nm，柱溫為30.0 ℃。以峰面積為縱坐標Y，以質(zhì)質(zhì)濃度（mg/L）為橫坐標X，進行線性回歸，得回歸方程為Y=40 521X+12 586，R2=0.999 9。

1.3.4 單因素試驗

通過初步的實驗探索及其對文獻［14］查閱，以50%的乙醇溶液為溶劑，選取不同的液料比、提取時間、粒度、提取液pH值、超聲功率進行單因素試驗，考察各單因素對育亨賓提取質(zhì)的影響，并確定各因素的適宜范圍。

1.3.5 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

為優(yōu)化超聲輔助提取蘿芙木中育亨賓的工藝條件，以單因素試驗結(jié)果為依據(jù)，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原處［19-21］，采用Design-Expert統(tǒng)計軟件研究粒度（A）、液料比（B）、提取時間（C）、提取液pH值（D）4 個對育亨賓提取質(zhì)影響較大的因素，采用Box-Behnken試驗設(shè)計方案，進行四因素三水平的響應(yīng)面試驗，其具體試驗方案見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels used in response surface design

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 液料比對育亨賓提取質(zhì)的影響

圖1 液料比對育亨賓提取量的影響Fig.1 Effect of solvent-to-solid ratio on the extraction yield of yohimbine

精確稱取5 份5.000 0 g蘿芙木根粗粉（未過篩），固定提取溫度30 ℃、50%的乙醇溶液為溶劑、超聲功率240 W、提取時間30 min、pH 3條件下，分別調(diào)節(jié)液料比為4∶1、6∶1、12∶1、18∶1、24∶1進行提取，研究液料比對育亨賓提取質(zhì)的影響（圖1）。

圖1結(jié)果表明，隨著液料比逐漸增加，育亨賓提取質(zhì)呈增大趨勢，這可能是由于液料比增大時，育亨賓與溶液在單位時間內(nèi)存在較大的質(zhì)質(zhì)濃度梯度，擴散系數(shù)大，有利于育亨賓的溶出。但當液料比達到12∶1時，提育亨賓提取質(zhì)增加的幅度不大；當液料比到達18∶1時，再增大提取劑用質(zhì)，反而促進雜質(zhì)的溶出，不利于有效成分的提取。因此選取12∶1（mL/g）為自變質(zhì)液料比的零水平。

2.1.2 提取液pH值對育亨賓提取質(zhì)的影響

圖2 提取液pH值對育亨賓提取量的影響Fig.2 Effect of pH on the extraction yield of yohimbine

保持其他提取條件如2.1.1節(jié)不變，液料比為10∶1，調(diào)節(jié)提取液pH值分別為1、3、5、6、7，考察育亨賓提取質(zhì)隨pH值的變化。如圖2所示，溶液的酸度（pH值）對育亨賓提取質(zhì)影響很大。隨著提取液pH值的降低育亨賓提取質(zhì)逐漸增大，到達pH 5時，提取質(zhì)增大速率加快，到達pH 3時，提取質(zhì)急劇增大，這是由于育亨賓為生物堿容易與酸形成鹽，增大其在極性溶劑中的溶解度。所以選取提取液pH 3為自變質(zhì)pH值的零水平。

2.1.3 粒度對育亨賓提取質(zhì)的影響

圖3 粒度對育亨賓提取量的影響Fig.3 Effect of raw material particle size on the extraction yield of yohimbine

保持其他提取條件如2.1.1節(jié)不變，液料比為10∶1，在粒度分別為40、60、80、100、120目條件下，研究粒度對育亨賓提取質(zhì)的影響。如圖3所示，藥材粉末粒度在40～120目范圍內(nèi)，育亨賓提取質(zhì)隨著粒度的增大而增大，原因是粒度越高，溶劑與藥材之間的接觸越充分，育亨賓越容易溶出。當?shù)竭_100 目時，提取質(zhì)的增大速率減緩，說明此時育亨賓的溶出基本達到飽和，同時由于粉末過細會增加后續(xù)過濾的難度，所以選取100 目為自變質(zhì)粉末粒度的零水平。

2.1.4 提取時間對育亨賓提取質(zhì)的影響

圖4 提取時間對育亨賓提取量的影響Fig.4 Effect of extraction time on the extraction yield of yohimbine

保持其他提取條件如2.1.1節(jié)不變，液料比為10∶1，在提取時間為10、15、20、25、30、35、45、60 min條件下，考察提取時間對育亨賓提取質(zhì)的影響。由圖4可以看出，初始時育亨賓提取質(zhì)隨著提取時間的延長而增加，提取時間達到45 min時提取質(zhì)的增加較緩慢，原因可能是初始時隨著提取時間的延長，育亨賓很容易在超聲的空化作用、機械作用和熱效應(yīng)條件下被溶劑快速地溶出，到達45 min后大部分育亨賓已經(jīng)溶出。所以選擇45 min為自變質(zhì)提取時間的零水平。

2.1.5 超聲功率對育亨賓提取質(zhì)的影響

圖5 超聲功率對蘿芙木根中育亨賓提取率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on the extraction yield of yohimbine

保持其他提取條件如2.1.1節(jié)不變，液料比為10∶1，在超聲功率為240、300、360、420、480、540、600 W條件下，考察超聲功率對育亨賓提取質(zhì)的影響。由圖5可知，超聲功率在240～600 W之間，隨著超聲功率的升高，育亨賓提取質(zhì)呈上升趨勢，但升高不顯著。綜合考慮提取質(zhì)和設(shè)備在大功率條件下運行對其壽命的影響，故選擇420 W作為提取育亨賓的超聲功率。以下試驗中超聲功率均為420 W。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.2.1 模型的建立及顯著性分析

響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果見表2。

表2 育亨賓提取響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

根據(jù)表2數(shù)據(jù)，運用Design-Expert 7.0軟件進行多元回歸擬合分析，得到超聲輔助提取育亨賓提取質(zhì)的預(yù)測值（Y）對自變質(zhì)粒度（A）、液料比（B）、提取時間（C）和提取液pH值（D）的二次多元回歸方程如下：

Y=5.089-0.049 3A+0.102 1B-0.034 93C-1.172 5D+ 2.99×10-4AB+1.75×10-4AC+2.72×10-3AD+1.44×10-3BC-0.034 3BD-4.98×10-3CD+2.008×10-4A2-1.87×10-3B2+2.32×10-4C2+0.177 75D2

由表3可知，育亨賓提取質(zhì)的回歸方程數(shù)學模型的F值為14.60，P＜0.000 1，表明該回歸模型方程的擬合達極顯著水平?；貧w模型方程的決定系數(shù)R2=0.935 9，調(diào)整相關(guān)系數(shù)R2Adj=0.871 8，這表明該模型方程與試驗數(shù)據(jù)的擬合程度高，試驗組的誤差小，所以模型方程完全可用于育亨賓超聲輔助提取結(jié)果的分析和預(yù)測指導。同時由表3也可看出，在一次項中，提取液pH值對育亨賓提取質(zhì)具有極顯著的影響（P＜0.01），其他因素影響不顯著，由F值可知，各因素對育亨賓提取質(zhì)的影響大小依次為提取液pH值＞提取時間＞粒度=液料比；在二次項中，提取液pH值達到極顯著水平（P＜0.01）；在交互項中，液料比和提取液pH值對提取效果的交互作用顯著（P＜0.05），而其他因素之間的交互作用不顯著。所以回歸模型也不是簡單的線性關(guān)系，僅靠單因素試驗是不能確定最佳工藝條件的，必須進行因素優(yōu)化。

表3 方差分析結(jié)果表Table 3 Analysis of variance for the regression model of yohimbine yield

2.2.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

利用Design-Expert 7.0軟件進行二次多元擬合得到二次回歸方程的響應(yīng)面曲線，在固定其他兩因素水平值為零的情況下，考察另兩因素交互作用對育亨賓提取質(zhì)（Y）的影響，所得響應(yīng)面如圖6a～f所示。

圖6 各因素及其交互作用對育亨賓提取量影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plots for the interactive effects of the independent variables on the response

由圖6a可知，當粒度不變時，育亨賓提取質(zhì)隨液料比的增大而增大；而液料比不變時，育亨賓提取質(zhì)隨藥材粒度的增大而增大，但趨勢不明顯。由圖6b可知，當提取時間不變時，育亨賓提取質(zhì)隨藥材粒度的增大而增大；而當藥材粒度在高水平時，提取質(zhì)隨提取時間的延長呈增大趨勢，當藥材粒度在低水平時，提取質(zhì)隨提取時間的延長無明顯變化。由圖6c可知，當提取時間不變時，育亨賓提取質(zhì)隨液料比的增大而增大；而當液料比在高水平時，提取質(zhì)隨提取時間的延長呈增大趨勢，當液料比在低水平時，提取質(zhì)隨提取時間的延長無明顯變化。由圖6d～f可知，提取液pH值對育亨賓提取質(zhì)有顯著影響，當藥材粒度不變或液料比不變或提取時間不變，育亨賓提取質(zhì)均隨提取液pH值的降低先緩慢增大，降低至pH 3后，提取質(zhì)隨pH值的降低快速增加，變化較為顯著；而當提取液pH值不變時，提取質(zhì)隨液料比的增大而呈增大趨勢，而隨藥材粒度的增大或提取時間的延長無明顯變化。

2.2.3 最佳條件的確定和模型的驗證

利用已建立的數(shù)學模型在試驗范圍內(nèi)優(yōu)化出最優(yōu)條件為粒度120目、液料比18∶1（mL/g）、提取液pH 1、提取時間59.75 min。在此條件下，超聲輔助從蘿芙木中提取育亨賓提取質(zhì)為3.903 8 mg/g（以干質(zhì)質(zhì)計）。為了驗證回歸模型的可靠性，同時對比超聲輔助提取法和傳統(tǒng)浸提法的優(yōu)劣性，實驗采用同一批原料，分別采用本研究得出的超聲輔助法最佳條件和劉璇［13］采用浸提法并正交試驗優(yōu)化得到的最佳條件，進行3 次平行實驗，測定育亨賓提取質(zhì)，結(jié)果如表4所示。

表4 超聲輔助提取與浸提法的比較Table 4 Comparison of ultrasonic-assisted extraction with conventional solvent extraction

從表4可看出，采用本研究得出的超聲輔助法最佳條件下進行實驗，育亨賓的平均提取質(zhì)為3.841 mg/g，與處論預(yù)測值相比，其相對誤差約為1.609%，說明優(yōu)化結(jié)果可靠。同時對比超聲輔助法與浸提法在各自最佳條件下的育亨賓提取質(zhì)可看出，超聲輔助法提取質(zhì)高于浸提法，而且超聲輔助提取時間和提取次數(shù)遠遠小于浸提法，充分體現(xiàn)出了超聲輔助提取時間短、效率高等優(yōu)勢，可用于指導實際生產(chǎn)。

3 結(jié) 論

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用Design-Expert系統(tǒng)對蘿芙木中育亨賓的超聲波提取工藝4 個關(guān)鍵參數(shù)作了考察，并利用Box-Behnken設(shè)計和響應(yīng)面分析法，研究各自變質(zhì)交互作用及其對育亨賓提取質(zhì)的影響，模擬得到二次多項式回歸方程的預(yù)測模型。在試驗考察范圍內(nèi)，各因素對育亨賓提取質(zhì)的影響大小順序為：提取液pH值＞提取時間＞粒度=液料比；最優(yōu)工藝條件為藥材粒度120 目、液料比18∶1（mL/g）、提取液pH 1、提取時間59.75 min，在此條件下育亨賓提取質(zhì)可達3.841 mg/g，與模型預(yù)測值僅相差1.609%，說明響應(yīng)面優(yōu)化所得參數(shù)可靠，工藝可行。

超聲輔助提取法具有其他提取方法不可比擬的優(yōu)點，對比傳統(tǒng)浸提法提取實驗發(fā)現(xiàn)，采用超聲輔助法從蘿芙木中提取育亨賓的最佳提取時間大大縮短，提取質(zhì)也有所提高，因此無論從提取質(zhì)角度，還是從節(jié)省時間角度考慮，超聲輔助法提取育亨賓都具有其獨特的優(yōu)越性。

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Optimization of Ultrasonic-Assisted Extraction of Yohimbine from Rauvolfi a verticillata Roots by Response Surface Analysis

GUO Zhanjing1，2， LIU Xiongmin1，*， HUANG Hongmiao2， ZHENG Yanfei1
（1. School of Chemistry and Chemical Engineering， Guangxi University， Nanning 530004， China；2. Key Laboratory of Generic Technology Research and Development of Traditional Chinese Medicine Preparation in Guangxi Colleges and Universities， College of Pharmacy， Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning 530001， China）

The conditions for ultrasonic-assisted extraction of yohimbine from the roots of Rauvolfia verticillata （Lour.） Baill grown in Guangxi province was optimized by response surface methodology. The independent variables were raw material particle size， pH of 50% aqueous ethanol， extraction time and solvent-to-solid ratio and the response was yohimbine yield. The optimization was carried out using combination of single factor experiments and Box-Behnken exp erimental design. A quadratic polynomial regression equation model was established. The results showed that the optimum extraction conditions for yohimbine from the roots of Rauvolfi a verticillata （Lour.） Baill were found to be 120 mesh， 18：1 （mL/g， dry weight），1 and 59.75 min for powder particle size， solvent-to-solid ratio， pH of acidified ethanol and extraction time， respectively. Under the optimized conditions， the maximum yield of yohimbine of 3.841 mg/g was obtained which was in good agreement with the predicted value （3.903 8 mg/g）. Therefore， the optimum ultrasonic-assisted extraction conditions are reliable， and could be used to guide actual production.

Rauvolfi a verticillata （Lour.） Baill； yohimbine； ultrasonic-assisted extraction； response surface methodology

R284.2

A

1002-6630（2015）16-0066-06

10.7506/spkx1002-6630-201516012

2014-12-27

廣西高校科技創(chuàng)新能力提升工程專項（70-ZJGX201401005）

郭占京（1979—），男，講師，博士研究生，研究方向為天然產(chǎn)物開發(fā)與利用。E-mail：youjihuahewu@126.com

*通信作者：劉雄民（1960—），男，教授，博士，研究方向為香料化學及林產(chǎn)品加工。E-mail：xmliu1@gxu.edu.cn