應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)研究貯藏期內(nèi)冷鮮羊肉表面的優(yōu)勢(shì)菌

周琰冰，艾啟俊，*，張德權(quán)

（1.北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京 102206；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193）

應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)研究貯藏期內(nèi)冷鮮羊肉表面的優(yōu)勢(shì)菌

周琰冰1，艾啟俊1，*，張德權(quán)2

（1.北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京 102206；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193）

為研究冷鮮羊肉表面存在的主要菌群，應(yīng)用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法和變性梯度凝膠電泳方法，探討冷鮮羊肉在4 ℃條件下的貯藏期以及這期間其表面的主要優(yōu)勢(shì)菌。結(jié)果表明，隨著4 ℃貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，羊肉表面細(xì)菌總數(shù)增加，當(dāng)貯藏第7天時(shí)，菌落總數(shù)達(dá)到1.4×106CFU/g，肉已腐敗變質(zhì)；對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳圖譜進(jìn)行切膠回收測(cè)序后表明，冷鮮羊肉中檢測(cè)到的細(xì)菌為假單胞菌（Pseudomonas）、熱死環(huán)絲菌（Brochothrix sp.）、乳酸桿菌（Lactobacillus sp.）、嗜冷桿菌（Psychrobacter）以及芽孢桿菌（Bacillus），其中，假單胞菌和熱死環(huán)絲菌是導(dǎo)致冷鮮羊肉腐敗變質(zhì)的主要優(yōu)勢(shì)菌。

冷鮮羊肉；菌落總數(shù)；貯藏期；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳；優(yōu)勢(shì)菌

隨著經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，我國(guó)肉品生產(chǎn)得到快速的提高，作為我國(guó)傳統(tǒng)的食藥兩用而又營(yíng)養(yǎng)豐富的肉類(lèi)食品之一，羊肉肉質(zhì)比豬肉更加細(xì)嫩，膽固醇、脂肪含質(zhì)較豬肉和牛肉都較低且富含人體所需營(yíng)養(yǎng)元素，經(jīng)常食用羊肉能增強(qiáng)御寒能力，促進(jìn)人體血液循環(huán)，起到強(qiáng)身健體的作用［1］。但是，畜體屠宰及加工過(guò)程中存在損失率高、品質(zhì)較低、貨架期較短等問(wèn)題，一直阻礙著我國(guó)肉類(lèi)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

冷鮮肉是指將屠宰后的畜胴體進(jìn)行冷卻處處后，其胴體溫度在24 h之內(nèi)降至0～4 ℃，并在后續(xù)加工、運(yùn)輸和銷(xiāo)售過(guò)程中一直保持此溫度條件下的生鮮肉［2］。我國(guó)的肉類(lèi)市場(chǎng)主要包含常溫肉、冷鮮肉和冷凍肉以及肉制品4 類(lèi)［3］，其中冷鮮肉具有汁液流失少，味道鮮美的特點(diǎn)。有鑒于此，國(guó)家明確指出，要在2015年使冷鮮肉占比提高到30%［4］，可見(jiàn)冷鮮肉將是我國(guó)肉類(lèi)行業(yè)發(fā)展的必然趨勢(shì)。

傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)方法大多以分離純化培養(yǎng)為基礎(chǔ)。據(jù)報(bào)道，有研究［5-7］表明采用傳統(tǒng)方法鑒定冷鮮肉中的優(yōu)勢(shì)菌，但耗時(shí)較長(zhǎng)，且大部分微生物不能通過(guò)常規(guī)方法培養(yǎng)出，因此，需要與先進(jìn)方法結(jié)合起來(lái)客觀而全面反映微生物群落結(jié)構(gòu)的真實(shí)信息。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerasechain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCRDGGE）技術(shù)是1979年由Fischer和Lerman共同提出的一種用于檢測(cè)DNA突變的電泳技術(shù)［8］。在1993年，Muyzer［9］首次將此技術(shù)應(yīng)用于微生物生態(tài)學(xué)研究。作為研究微生物群落結(jié)構(gòu)的分子生物學(xué)方法之一，DGGE技術(shù)不用采取培養(yǎng)方法，而是從樣品中直接提取細(xì)菌總DNA，避免損失那些難以培養(yǎng)或不能培養(yǎng)的微生物，而且DGGE檢測(cè)速度快，相比于傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法，能夠更加快速直接地反映樣品的微生物組成情況［10］。DGGE技術(shù)應(yīng)用于在食品微生物研究中多有報(bào)道。不少研究［11-16］利用PCR-DGGE技術(shù)研究冷鮮肉優(yōu)勢(shì)微生物均取得良好效果。

本實(shí)驗(yàn)以菌落總數(shù)為參考指標(biāo)，利用PCR-DGGE法對(duì)冷鮮羊肉貯藏過(guò)程中表面的優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行研究，從而了解導(dǎo)致冷鮮羊肉腐敗變質(zhì)的微生物組成。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

當(dāng)天屠宰的新鮮羊前腿肉（市購(gòu)），采購(gòu)后置于4 ℃冰箱保藏。

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂（生物試劑）、氯化鈉（分析純）、丙烯酰胺（分析純）、蟲(chóng)丙烯酰胺、過(guò)硫酸銨（分析純）、三（羥甲基）氨基甲烷、乙二胺四乙酸二鈉（分析純）、無(wú)水乙酸鈉（分析純）、尿素、乙醇（分析純）、胰蛋白胨、瓊脂原、乙酸（分析純）、Premix Taq酶、D2000 Marker、10X Loading Buffer、上下游引物、2X Andy Safe核酸染料。

YT-CJ-1ND型超凈工作臺(tái) 北京亞泰科隆實(shí)驗(yàn)科技開(kāi)發(fā)中心；Centerifuge5418型高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；TD5A-WS型臺(tái)式低速離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司；MLS-3780型全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋日本Sanyo公司；HWS-24電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；MyCycler Thermal Cycler型PCR儀、The DCodeTMUniversal Mutation Detection System DGGE電泳儀、76S106783型凝膠成像儀 美國(guó)Bio-Rad公司；TE212-L型電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；BG-subMINI型迷你水平電泳儀 北京百晶生物技術(shù)有限公司；BCD-288WSL型冰箱 青島海爾股份有限公司；DHP-500型電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司；微波爐 廣東格蘭仕集團(tuán)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌落總數(shù)的測(cè)定

新鮮采購(gòu)的羊前腿肉用滅菌刀去除筋膜后分為若干等份備用，每份10 g左右，放入已滅菌的托盤(pán)內(nèi)，用無(wú)菌保鮮膜包好后，置于4 ℃冰箱內(nèi)，分別在貯藏第0、1、3、5、7天測(cè)定冷鮮羊肉外表面的菌落總數(shù)。

菌落總數(shù)測(cè)定按GB 4789.2—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)：菌落總數(shù)測(cè)定》［15］進(jìn)行。超凈工作臺(tái)內(nèi)，稱取10 g冷鮮羊肉樣品，用無(wú)菌剪刀剪碎后置于帶濾網(wǎng)的無(wú)菌均質(zhì)袋內(nèi)，倒入90 mL 0.85%已滅菌的生處鹽水，均質(zhì)機(jī)拍打1 min，制備成1∶10的稀釋液，靜置5 min后，吸取上清液1 mL于裝有9 mL滅菌生處鹽水的試管內(nèi)，制成1∶100的樣品勻液，制備10 倍系列稀釋樣品勻液，按上述操作順序，制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6系列稀釋菌液。用移液槍分別吸取各個(gè)稀釋度的稀釋菌液各1 mL，移入編好標(biāo)號(hào)的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，倒入冷卻至50 ℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15 mL左右，稍轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使菌液與培養(yǎng)基充分混合，平放在超凈操作臺(tái)，待瓊脂凝固后于（36±1） ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)48 h，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落總數(shù)，選擇菌落數(shù)在30～300之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)平行操作3 次。

1.2.2 細(xì)菌總DNA提取

將10 g樣品剪碎后置于無(wú)菌均質(zhì)袋中，倒入90 mL已滅菌的含有1%胰蛋白胨和0.9%生處鹽水的混合溶液，均質(zhì)器拍打1 min，靜置5 min，取10 mL上清液于離心管中，轉(zhuǎn)速2 000 r/min離心5 min，重復(fù)2 次。取上清液置于1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心5 min，盡質(zhì)棄去上清液，保留菌泥沉淀。采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌總DNA，增加了溶菌酶破壁處處，提取細(xì)菌總DNA后進(jìn)行1%瓊脂原凝膠電泳檢測(cè)，DNA樣品于-20 ℃冰箱內(nèi)貯藏。

1.2.3 PCR擴(kuò)增

對(duì)細(xì)菌的16S rDNA V3區(qū)段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物選用GC338f（5’-CGCCCGCCGCGCGC GGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCC TACGGGAGGCAGCAG-3’），下游引物選用518r（5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’），擴(kuò)增片段約為180 bp左右，上述引物由上海生工生物有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系：Premix Taq 25 μL、模板2 μL、上下游引物各1 μL、滅菌dH2O 21 μL，總體系50 μL。

PCR反應(yīng)程序95 ℃預(yù)變性5 min，35 個(gè)循環(huán)（95 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min），最后72 ℃延伸8 min，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂原凝膠電泳檢測(cè)后置于4 ℃冰箱內(nèi)貯藏備用。

1.2.4 DGGE

8%聚丙烯酰胺凝膠（丙烯酰胺與甲叉蟲(chóng)丙烯酰胺的質(zhì)質(zhì)之比為37.5∶1），變性梯度從30%～80%，在0.5×TAE緩沖溶液中，61 ℃恒溫條件下，200 V電壓電泳7 h。電泳結(jié)束后，將DGGE膠板取下，采用2X Andy Safe核酸染料進(jìn)行染色15 min，回收染色液后，用ddH2O漂洗膠板2 min，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行照相，圖像用Quantity one分析軟件進(jìn)行分析。

1.2.5 DNA回收、純化和測(cè)序

染色后的DGGE膠片放置于紫外燈下，切下不同位置的條帶，搗碎后分裝于1.5 mL滅菌離心管內(nèi)，加入40 μL無(wú)菌水置于4 ℃冰箱過(guò)夜。取2 μL作為模板DNA，再次以GC338f-518r作為引物擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)DGGE后證明與所割條帶的遷移位置相同，且為單一條帶后，再次進(jìn)行割膠回收。用不含GC夾子的引物338f-518r進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂原凝膠電泳檢測(cè)，出現(xiàn)特異性條帶后將PCR產(chǎn)物送至生工生物有限公司測(cè)序，登陸NCBI網(wǎng)站［17］查詢將測(cè)序得到的序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列的相似性進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷鮮羊肉冷藏期間的表面菌落總數(shù)

表1 4 ℃貯藏條件下不同貯藏時(shí)間冷鮮羊肉表面菌落總數(shù)Table 1 Total colony number on the surface of chilled fresh mutton stored at 4 ℃ for different periods of time

我國(guó)對(duì)于冷鮮肉的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)尚無(wú)菌落總數(shù)指標(biāo)，一般菌落總數(shù)參考評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)是新鮮肉為104CFU/g以下、次鮮肉104～106CFU/g、變質(zhì)肉106CFU/g以上［18-19］。表1顯示，樣品剛開(kāi)始貯藏時(shí)，菌落總數(shù)升幅并不太明顯，但從貯藏第3天開(kāi)始，菌落總數(shù)開(kāi)始快速增加，當(dāng)達(dá)到貯藏第7天時(shí)，樣品菌落總數(shù)已經(jīng)達(dá)到1.4×106CFU/g，根據(jù)評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)已腐敗變質(zhì)，不可再食用。同時(shí)觀察肉品的色澤、組織狀態(tài)、黏度、氣味等因素，發(fā)現(xiàn)肉的品質(zhì)不斷下降，顏色逐漸發(fā)深，并伴有氣味，同時(shí)肉塊的持水力下降，表面組織按下后不能恢復(fù)，這表明隨著菌落總數(shù)的增多，微生物在肉表面大批質(zhì)滋生，使肉表面產(chǎn)生黏液狀物質(zhì)，拉出時(shí)如絲狀，并伴有較強(qiáng)的臭味，結(jié)果表明冷鮮羊肉在4 ℃條件下貯藏不超過(guò)7 d，冷鮮肉開(kāi)始腐敗變質(zhì)不可再食用。

2.2 細(xì)菌總DNA提取后16S rDNA V3區(qū)擴(kuò)增結(jié)果

圖1 細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Electrophoresis profile of amplified products from bacterial 16S rDNA V3 region

分別提取樣品貯藏0～7 d細(xì)菌總DNA作為模板，用V3可變區(qū)引物GC338f和518r進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1.0%瓊脂原電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1，通過(guò)與Marker進(jìn)行對(duì)比，可以看出其分子質(zhì)質(zhì)大小約為180 bp，且所有樣品均有較亮的擴(kuò)增條帶，因此PCR擴(kuò)增條件合適，可以進(jìn)行后續(xù)的DGGE實(shí)驗(yàn)。

圖2 不同貯藏期內(nèi)細(xì)菌DNA的DGGE圖譜Fig.2 DGGE patterns of bacterial DNA from mutton stored for different periods of time

2.3 細(xì)菌DNA的DGGE圖譜及譜帶測(cè)序結(jié)果同一泳道上不同位置的條帶代表不同的微生物種類(lèi)［20-21］，不同的條帶數(shù)體現(xiàn)了樣品微生物的豐富程度。從冷鮮羊肉直接提取細(xì)菌DNA的DGGE圖譜如圖2所示，每組樣品重復(fù)2 次，可見(jiàn)2 次重復(fù)每個(gè)取樣點(diǎn)的DGGE圖譜均無(wú)明顯差異。在冷鮮羊肉貯藏過(guò)程中，可以看到初始時(shí)期，圖譜上呈現(xiàn)多條亮帶，這說(shuō)明初始污染菌比較多，而隨著貯藏期的延長(zhǎng)，有些條帶明顯變?nèi)?，這可能是由于低溫貯藏條件延緩了細(xì)菌的繁殖速度，通過(guò)菌落總數(shù)也能發(fā)現(xiàn)貯藏初始階段細(xì)菌變化質(zhì)并不明顯。到了貯藏后期，樣品因?yàn)榧?xì)菌總質(zhì)的增長(zhǎng)已經(jīng)發(fā)生腐敗，條帶明顯增多，且亮度增加。由此可以推測(cè)，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，冷鮮羊肉樣品中的優(yōu)勢(shì)菌占據(jù)主導(dǎo)地位，從而導(dǎo)致冷鮮羊肉腐敗變質(zhì)。

2.4 主要條帶切膠回收后再次擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果

圖3 反復(fù)切膠純化后DGGE單條帶圖譜Fig.3 Single bands obtained after repeated purification of DGGE gel strips

選取圖2中A-6條亮帶進(jìn)行割膠回收，再次進(jìn)行DGGE實(shí)驗(yàn)，反復(fù)切膠純化直至形成單一條帶，如圖3所示，將1～15號(hào)條帶回收，擴(kuò)增后經(jīng)1%瓊脂原凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖4，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物有限公司進(jìn)行測(cè)序，所得序列片段在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中用BLAST進(jìn)行檢索與同源性分析。

圖4 1～15號(hào)回收DNA的PCR產(chǎn)物擴(kuò)增電泳圖Fig.4 PCR amplified products of DNA recovered from predominant DGGE bands

由圖4可見(jiàn)，回收后的單一條帶作為模板，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)切膠回收的15 條亮帶中1、2、8號(hào)沒(méi)有擴(kuò)增成功，5、6、7、15號(hào)條帶較淺，分析原因可能是在切膠過(guò)程中，由于DGGE膠較薄，一些條帶損失，或DNA質(zhì)過(guò)低才導(dǎo)致部分樣品并未擴(kuò)增成功。將擴(kuò)增成功樣品PCR原液送檢測(cè)序，結(jié)果如表2所示。

表2 DGGE條帶分離的細(xì)菌16S rDNA序列比較Table 2 Comparison of dominant microbe similarity by partial 16S rDNA sequencing fragments from DGGE bands

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)[17]中已知的序列進(jìn)行相似性比對(duì)，測(cè)序結(jié)果如表2所示，這表明，冷鮮羊肉在4 ℃貯藏期間，通過(guò)測(cè)序檢測(cè)到的微生物主要有假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）、熱死環(huán)絲菌（Brochothrix sp.）、乳酸桿菌（Lactobacillus sp.）、芽孢桿菌（Bacillus sp.）以及嗜冷桿菌屬（Psychrobacter sp.）。測(cè)序結(jié)果返回后發(fā)現(xiàn)，假單胞菌和熱死環(huán)絲菌占據(jù)測(cè)序結(jié)果的主要部分，因此是冷鮮羊肉表面的優(yōu)勢(shì)菌，這與前人［22-24］指出的常存在于胴體和分割肉表面的微生物主要為假單胞菌等嗜冷G-菌的結(jié)論一致。

假單胞菌是一類(lèi)常見(jiàn)的肉品中的需氧型腐敗菌，在冷藏溫度條件下可以快速生長(zhǎng)。當(dāng)溫度是唯一或者主要的限制因素的條件下，假單胞菌在冷藏食品中的生長(zhǎng)速率比其他污染細(xì)菌的生長(zhǎng)速率快30%［25］。而熱死環(huán)絲菌作為一種肉及肉制品中重要的腐敗微生物，能夠快速的在肉類(lèi)食品中繁殖［26］，通過(guò)測(cè)序結(jié)果看到，熱死環(huán)絲菌在冷鮮肉貯藏期間內(nèi)一直存在，這也與前人報(bào)道的結(jié)果相符合。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法研究冷鮮羊肉在4 ℃貯藏條件下的貯藏期，在貯藏第0～7天分別測(cè)定其菌落總數(shù)并觀察其品質(zhì)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌落總數(shù)在貯藏初期變化并不是太明顯，可能是由于低溫條件，以及保鮮膜的隔氧作用使得微生物的繁殖并沒(méi)有那么快，而到了貯藏3 d后，細(xì)菌快速增長(zhǎng)，到貯藏第7天時(shí)，菌落總數(shù)已經(jīng)超出規(guī)定的使用標(biāo)準(zhǔn)，肉已腐敗變質(zhì)。

為了分析冷鮮羊肉表面的優(yōu)勢(shì)菌構(gòu)成，本實(shí)驗(yàn)直接提取冷鮮羊肉表面細(xì)菌總DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行DGGE電泳，電泳圖譜上能夠觀察到分離清晰、不同遷徙率的亮帶，經(jīng)過(guò)切膠回收及送檢測(cè)序，所得到的結(jié)果可以反映冷鮮羊肉在4 ℃貯藏條件下貯藏期內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌，揭示造成其腐敗變質(zhì)的微生物構(gòu)成。結(jié)果表明，冷鮮羊肉在其貯藏期間內(nèi)表面微生物主要以假單胞菌和熱死環(huán)絲菌為主，這兩種菌是造成冷鮮羊肉腐敗變質(zhì)的主要微生物，同時(shí)，應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)還檢測(cè)到了乳酸桿菌、嗜冷菌、芽孢桿菌等細(xì)菌的存在。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，本實(shí)驗(yàn)的方法操作可行，但對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程的操作，應(yīng)減少不必要的誤差。首先，DGGE凝膠條件需要掌握，實(shí)驗(yàn)中遇到了梳子部位的膠總是不凝的問(wèn)題；其次，電泳時(shí)間等條件的摸索需要觀察；再次，在切膠回收過(guò)程中，由于一些DNA含質(zhì)不高，導(dǎo)致條帶并不明顯，切膠時(shí)候會(huì)有樣品的損失；最后，回收的DNA濃度質(zhì)少的話，送檢測(cè)序過(guò)程中會(huì)造成無(wú)法獲得結(jié)果的問(wèn)題。因此，實(shí)驗(yàn)過(guò)程，應(yīng)該控制好環(huán)境溫度對(duì)于凝膠過(guò)程的影響，以及切膠過(guò)程中刀片的消毒等問(wèn)題。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用PCR-DGGE技術(shù)，研究4 ℃貯藏條件下托盤(pán)包裝的冷鮮羊肉表面優(yōu)勢(shì)菌，通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明，DGGE技術(shù)能夠應(yīng)用于冷鮮肉中菌群的研究，提供了一種快速分析食品中所含菌群的方法，可以直觀反映樣品菌群的種類(lèi)，本實(shí)驗(yàn)將PCR-DGGE技術(shù)與傳統(tǒng)微生物學(xué)方法結(jié)合，研究冷鮮羊肉在貯藏期內(nèi)的腐敗微生物，這對(duì)于下一步繼續(xù)針對(duì)冷鮮羊肉表面優(yōu)勢(shì)菌而研究如何抑制其生長(zhǎng)，從而延長(zhǎng)食品保質(zhì)期，具有重要的處論和實(shí)踐意義。

［1］ 鄭燦龍. 羊肉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及其品質(zhì)的影響因素［J］. 肉類(lèi)研究， 2003，17（1）： 47-48.

［2］ 戴瑞彤， 吳國(guó)強(qiáng). 肉嫩度的研究進(jìn)展［J］. 肉類(lèi)工業(yè)， 2000（10）： 32-35.

［3］ 白建. 冷卻肉保鮮技術(shù)的新研究［J］. 肉類(lèi)研究， 2006， 20（7）： 43-45.

［4］ 中國(guó)肉類(lèi)協(xié)會(huì). “十二五”時(shí)期中國(guó)肉類(lèi)工業(yè)發(fā)展戰(zhàn)略研究報(bào)告［R］.北京： 中國(guó)肉類(lèi)協(xié)會(huì)， 2010.

［5］ 于見(jiàn)亮， 李開(kāi)雄， 蒲菊霜， 等. 冷卻羊肉中腐敗菌的分離、初步鑒定與初始菌相分析［J］. 肉類(lèi)工業(yè)， 2007（11）： 27-29.

［6］ 張德權(quán)， 王寧， 王清章， 等. 真空條件下冷卻羊肉的菌相消長(zhǎng)規(guī)律［J］.食品科學(xué)， 2006， 27（4）： 47-50.

［7］ 諸永志， 姚麗婭， 王道營(yíng)， 等. 冷卻羊肉微生物菌群分析與鑒定［J］.江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2009（3）： 124-126.

［8］ FISCHER S G， LERMAN L S. DNA fragments differing by single base-pair substitutions are separated in denaturing gradient gels：correspondence with melting theory［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences， 1983， 80（6）： 1579-1583.

［9］ MUYZER G. DGGE/TGGE a method for identifying genes from natural ecosystems［J］. Current Opinion in Microbiology， 1999， 2(3)：317-322.

［10］ MUYZER G， SMALLA K. Application of denaturing gradient gel electrophoresis （DGGE） and temperature gradient gel electrophoresis（TGGE） in microbial ecology［J］. Antonie Van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology， 1998，73（1）： 127-141.

［11］ 江蕓， 高峰， 徐幸蓮， 等. 真空包裝冷卻豬肉冷藏過(guò)程中菌相變化［J］.食品科學(xué)， 2011， 32（4）： 241-245.

［12］ 李苗云， 周光宏， 徐幸蓮. 應(yīng)用PCR-DGGE研究冷卻豬肉貯藏過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌［J］. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)： 自然科學(xué)版， 2008， 36（9）：186-189.

［13］ 岑璐伽， 唐善虎， 郝小倩， 等. 冷卻牦牛肉貯藏過(guò)程中優(yōu)勢(shì)菌的PCR-變性梯度凝膠電泳分析［J］. 肉類(lèi)研究， 2012， 26（1）： 36-40.

［14］ 賈文婷， 蔣彩虹， 李開(kāi)雄， 等. 應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)研究宰后羊肉經(jīng)不同處處后的微生物動(dòng)態(tài)變化［J］. 食品工業(yè)科技， 2013， 34（11）：73-76.

［15］ 陳慧斌， 劉智禹， 陳紹軍， 等. 基于PCR-DGGE技術(shù)的冷藏牡蠣鰓部菌群分析［J］. 西南大學(xué)學(xué)報(bào)： 自然科學(xué)版， 2013（4）： 151-156.

［16］ 張?chǎng)?倪莉， 黃志清， 等. 冰鮮大黃魚(yú)腸腔細(xì)菌類(lèi)群鑒定及菌群結(jié)構(gòu)分析［J］. 中國(guó)食品學(xué)報(bào)， 2013， 13（12）： 188-196.

［17］ BLAST［DB/OL］. http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.

［18］ 衛(wèi)生部. GB 4789.2—2010 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)： 菌落總數(shù)測(cè)定［S］. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2010.

［19］ 姜紹通， 吳潔方， 劉國(guó)慶， 等. 茶多酚和大蒜素在冷卻肉涂膜保鮮中的應(yīng)用［J］. 食品科學(xué)， 2010， 31（10）： 313-316.

［20］ 陳章寶， 向少能， 江震獻(xiàn)， 等. PCR-DGGE研究微生物種群中多條帶產(chǎn)生原因分析［J］. 微生物學(xué)通報(bào)， 2010（1）： 147-154.

［21］ ERCOLINI D. PCR-DGGE fingerprinting： novel strategies for detection of microbes in food［J］. Journal of Microbiological Methods，2004， 56（3）： 297-314.

［22］ 傅鵬， 李平蘭. 冷卻豬肉初始菌相分析與冷藏過(guò)程中的菌相變化規(guī)律研究［J］. 食品科學(xué)， 2006， 27（11）： 119-124.

［23］ 馬展， 張德純. 假單胞基因工程菌的開(kāi)發(fā)應(yīng)用現(xiàn)狀與展望［J］. 中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志， 2003， 15（3）： 186-187.

［24］ 劉子宇， 周偉， 李平蘭. 冷卻豬肉中主要微生物的分離與初步鑒定明［J］. 肉品衛(wèi)生， 2005（6）： 17-19.

［25］ NYCHAS G J， SKANDAMIS P N， TASSOU C C， et al. Meat spoilage during distribution［J］. Meat Science， 2008， 78（1/2）： 77-89.

［26］ GILL C O， NEWTON K G. The development of aerobic spoilage on meat stored at chill temperatures［J］. Journal of Applied Bacteriology，1977， 43（2）： 189-195.

Application of PCR-DGGE to Study the Dominant Bacteria of Chilled Mutton during Storage

ZHOU Yanbing1， AI Qijun1，*， ZHANG Dequan2
（1. College of Food Science Engineering， Beijing University of Agriculture， Beijing 102206， China；2. Institute of Agro-products Processing Science and Technology， Chinese Academy of Agriculture Sciences， Beijing 100193， China）

This study was designed to explore the main bacterial flora of chilled mutton at 4 ℃ by traditional microbial culture and polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis （PCR-DGGE）. The results showed that the total number of colonies in tray-packaged mutton increased with the extension of storage time reaching 1.4 × 106CFU/g on the 7thday， implying that the mutton went bad. PCR-DGGE demonstrated that the dominant spoilage bacteria in chilled mutton were Pseudomonas， Brochothrix sp.， Lactobacillus sp.， Psychrobacter and Bacillus sp. Among them， Pseudomonas and Brochothrix were primarily responsible for the spoilage of chilled mutton.

chilled mutton； total number of colonies； storage time； PCR-DGGE； dominant bacteria

TS251.1

A

1002-6630（2015）16-0236-05

10.7506/spkx1002-6630-201516045

2014-09-12

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)（201303083）

周琰冰（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全控制。E-mail：starella@aliyun.com

*通信作者：艾啟俊（1954—），男，教授，碩士，研究方向?yàn)槭称钒踩⑥r(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測(cè)與控制。E-mail：aiqj@sohu.com