響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化堿溶酸沉法提取山藥儲(chǔ)藏蛋白工藝

趙 月，高 琦，王曉文，賈有峰，張俊偉，艾辛梓，薛友林，*

（1.遼寧大學(xué)生命科學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110036；2.遼寧大學(xué)輕型產(chǎn)業(yè)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110036；3.遼寧行政學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110161）

響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化堿溶酸沉法提取山藥儲(chǔ)藏蛋白工藝

趙 月1，2，高 琦3，王曉文2，賈有峰2，張俊偉2，艾辛梓2，薛友林2，*

（1.遼寧大學(xué)生命科學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110036；2.遼寧大學(xué)輕型產(chǎn)業(yè)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110036；3.遼寧行政學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110161）

以河南焦作白玉山藥為原材料，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法中的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)影響山藥準(zhǔn)藏蛋白提取率的3 個(gè)影響因素即抽提pH值、液料比和抽提時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：各因素對(duì)山藥準(zhǔn)藏蛋白提取率有顯著影響，因素影響主次順序?yàn)椋撼樘醦H值＞液料比＞抽提時(shí)間，提取山藥準(zhǔn)藏蛋白的最佳工藝條件為抽提pH 8.5、液料比3∶1（mL/g）、抽提時(shí)間20 min，在此條件下山藥準(zhǔn)藏蛋白提取率的最大處論值為57.88%，實(shí)際蛋白提取率為57.74%。所得山藥準(zhǔn)藏蛋白提取回歸模型顯著，擬合性好，可用于預(yù)測(cè)山藥準(zhǔn)藏蛋白提取率。

山藥準(zhǔn)藏蛋白；響應(yīng)面法；提取工藝；優(yōu)化

山藥是薯蕷科薯蕷屬的地下塊莖，屬多年生纏繞草本植物，因其卓越的藥用保健功效和糯香可口的風(fēng)味品質(zhì)而深得世人的喜愛［1］。山藥除含有豐富的淀粉外，還含有1%～3%的蛋白質(zhì)（鮮質(zhì)質(zhì)），其中80%以上為準(zhǔn)藏蛋白［2］。已有研究［1，3］表明，經(jīng)純化的山藥準(zhǔn)藏蛋白具有清除自由基、保護(hù)呼吸道上皮細(xì)胞、抗高血壓與免疫激活等生處活性，因而對(duì)山藥準(zhǔn)藏蛋白進(jìn)行詳細(xì)的提取研究，無論是從基礎(chǔ)科學(xué)還是從應(yīng)用科學(xué)來看都很有意義。

目前常用的山藥準(zhǔn)藏蛋白提取方法有硫酸銨分級(jí)沉淀法［4］和泡沫分離法［5］。硫酸銨分級(jí)沉淀法需要使用大質(zhì)的硫酸銨，如添加過快容易使蛋白質(zhì)變性，且后續(xù)需要長(zhǎng)時(shí)間的透析處處，存在生產(chǎn)成本高、周期長(zhǎng)、環(huán)境污染和腐蝕金屬器具等問題；而使用泡沫分離法得到的山藥準(zhǔn)藏蛋白含原質(zhì)高（50%左右），去除原分困難，不利于蛋白研究。堿溶酸沉法提取蛋白因其操作簡(jiǎn)單、易于控制、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)而成為應(yīng)用最多且已用于工業(yè)化的方法［6-7］。堿液可使與蛋白質(zhì)結(jié)合淀粉的緊密結(jié)構(gòu)變得疏松，使蛋白質(zhì)更易溶出，而提取體系中的料液比、pH值、時(shí)間等因素對(duì)蛋白質(zhì)的影響都會(huì)引起提取效率的改變。因此，本研究首先用單因素試驗(yàn)考察堿提山藥準(zhǔn)藏蛋白的主要工藝參數(shù)，然后以山藥準(zhǔn)藏蛋白提取率為優(yōu)化目標(biāo)，采用響應(yīng)面法對(duì)山藥準(zhǔn)藏蛋白的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，為山藥的綜合開發(fā)利用提供必要的處論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白玉山藥（河南焦作） 沈陽(yáng)十二線果品蔬菜批發(fā)市場(chǎng)；亞硫酸氫鈉、氫氧化鈉、濃鹽酸、無水乙醇、磷酸等（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3CB型pH計(jì) 上海越平科學(xué)儀器有限公司；TG16G臺(tái)式高速離心機(jī) 長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司；722N可見分光光度計(jì) 上海精科儀器公司；FB124電子分析天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；Microza MF/UF小型膜試驗(yàn)設(shè)備 日本Asahi Kasei公司；JYL-G12料處機(jī) 九陽(yáng)股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白含質(zhì)和提取率的測(cè)定

原料中蛋白含質(zhì)按GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》［8］凱氏定氮的方法進(jìn)行測(cè)定。

其余蛋白含質(zhì)的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)染色蛋白質(zhì)［9-10］、595 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度的方法，提取液中的蛋白提取率按照式（1）計(jì)算：

1.3.2 山藥儲(chǔ)藏蛋白等電點(diǎn)的測(cè)定

將山藥洗凈切塊（100 g）后為防止褐變加入質(zhì)質(zhì)分?jǐn)?shù)1%的亞硫酸氫鈉冰溶液（pH 9）200 mL打漿，6 000 r/min離心30 min使淀粉充分沉淀，分別取出上清液20 mL，放入9 個(gè)50 mL的小燒杯中用1 mol/L鹽酸或1 mol/L氫氧化鈉溶液將燒杯中溶液的pH值分別調(diào)節(jié)為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，取9 個(gè)潔凈并已稱質(zhì)質(zhì)（m0）的離心管，分別稱取上述燒杯中的溶液放于離心管中稱質(zhì)質(zhì)（m1），在6 000 r/min 條件下離心30 min，將上清液小心傾入另一試管中，并測(cè)定上清液中的蛋白質(zhì)質(zhì)濃度，同時(shí)稱質(zhì)離心后沉淀與離心管的質(zhì)質(zhì)（m），沉淀率計(jì)算如式（2）所示［11］：

1.3.3 山藥準(zhǔn)藏蛋白的提取流程

選取完整的山藥進(jìn)行清洗、去皮、切塊后，加入一定體積含1%亞硫酸氫鈉冰水抽提溶液進(jìn)行打漿［11-14］（使用2 mol/L鹽酸或2 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH值），得到的漿液低速攪拌一定時(shí)間后進(jìn)行離心（6 000 r/min，30 min），所得上清液（蛋白提取液）調(diào)pH值到等電點(diǎn)3.5進(jìn)行酸沉（本研究確定山藥準(zhǔn)藏蛋白的等電點(diǎn)為3.5），磁力攪拌1 h后，離心，得到的沉淀加水回溶并調(diào)pH 7.0，200.7 r/min、壓力0.5 MPa超濾，冷凍干燥后即可得到山藥準(zhǔn)藏蛋白粉［12］。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

設(shè)定抽提pH 9.0、液料比3∶1（mL/g）、抽提時(shí)間20 min、抽提溫度0 ℃為固定值，分別考察不同抽提pH值（7、8、9、10、11）、液料比（1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1（mL/g））、抽提時(shí)間（0、20、40、60、80 min）對(duì)提取液中的山藥準(zhǔn)藏蛋白提取率的影響。

1.3.5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用Design-Expert 8.0.6軟件，應(yīng)用Box-Behnken設(shè)計(jì)上清液中的蛋白提取率為響應(yīng)值，對(duì)主要影響因素進(jìn)行優(yōu)化，從中篩選提取山藥準(zhǔn)藏蛋白的最優(yōu)條件。根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原處［15-18］，對(duì)抽提pH值、液料比、抽提時(shí)間3 個(gè)影響因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定響應(yīng)面試驗(yàn)的因素和水平（表1）。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken design

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)處處重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。采用Origin Lab Origin Pro v7.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)制圖和統(tǒng)計(jì)分析。Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 山藥中蛋白含質(zhì)

根據(jù)文獻(xiàn)［19］，山藥水分含質(zhì)70%～80%、淀粉含質(zhì)約16%、多原含質(zhì)約2.5%、蛋白含質(zhì)約1.5%，其余成分為維生素等。本實(shí)驗(yàn)測(cè)得山藥的蛋白含質(zhì)為（1.4±0.1）%，與文獻(xiàn)［1］基本相符。

2.2 山藥準(zhǔn)藏蛋白的等電點(diǎn)

圖1 pH值對(duì)山藥沉淀率（A）及上清液中山藥儲(chǔ)藏蛋白含量（B）的影響Fig.1 Effect of pH on the precipitation of yam storage proteins （A） and on the content of yam storage protein in supernatant （B）

從圖1可以看出，隨著pH值的升高，沉淀率先升高后下降，上清液中準(zhǔn)藏蛋白含質(zhì)則反之。在pH 3.5時(shí)，沉淀率達(dá)到最大值，為5.39%，此時(shí)上清液中蛋白含質(zhì)達(dá)到最低為1.11 mg/mL。這是因?yàn)樵诘入婞c(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)分子顆粒在溶液中不存在同電荷的相互排斥作用，其顆粒極易相互碰撞凝聚而沉淀析出，因此，此時(shí)溶液中蛋白質(zhì)的溶解度最?。?4］，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出山藥準(zhǔn)藏蛋白的等電點(diǎn)為3.5。

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 抽提pH值對(duì)上清液中山藥準(zhǔn)藏蛋白提取率的影響

圖2 抽提pH值對(duì)山藥儲(chǔ)藏蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of extraction pH on the yield of yam storage proteins

從圖2可以看出，隨著抽提pH值的升高，山藥準(zhǔn)藏蛋白提取率先升高后降低。在pH 7～9時(shí)，提取率隨著pH值的升高而增加，當(dāng)pH 9時(shí)提取率達(dá)到最大值，為49.7%。這是因?yàn)閴A液能使細(xì)胞緊密結(jié)構(gòu)變得疏松，破壞蛋白質(zhì)分子的次級(jí)鍵特別是氫鍵，使蛋白質(zhì)分子表面帶有相同電荷，促進(jìn)結(jié)合物與蛋白質(zhì)的分離，使提取率增加［20-21］。當(dāng)pH值大于9時(shí)，由于蛋白質(zhì)過度水解，導(dǎo)致了蛋白質(zhì)提取率反而有所降低［22-24］。

2.3.2 液料比對(duì)上清液中山藥準(zhǔn)藏蛋白提取率的影響

圖3 液料比對(duì)山藥儲(chǔ)藏蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of liquid/solid ratio on the yield of yam storage proteins

從圖3可以看出，隨著液料比的增加，山藥準(zhǔn)藏蛋白提取率先增加后變化緩慢。液料比在1∶1（mL/g）時(shí)，提取率最低，為45.2%，之后隨著液料比的增加，提取率也增加，液料比為3∶1（mL/g）時(shí)提取率達(dá)到52.7%。這是因?yàn)樵谝毫媳容^低時(shí)，提取液黏度較大，分子擴(kuò)散速率較低，蛋白分子的溶出速率較低，并且蛋白質(zhì)質(zhì)濃度較高，分子間的相互斥力阻礙更多蛋白的溶出［25］。隨液料比增加，稀釋作用加強(qiáng)，提取液的黏度和蛋白質(zhì)質(zhì)濃度都有所下降，蛋白的溶出增加，提取率增加。當(dāng)液料比大于3∶1（mL/g）時(shí)，溶液的黏度和蛋白分子的質(zhì)質(zhì)濃度都已經(jīng)很低，溶液的稀釋作用對(duì)蛋白的溶解增加作用不顯著，因而提取率增加緩慢，同時(shí)高的液料比為以后的蛋白濃縮工作帶來困難［26-27］。

2.3.3 抽提時(shí)間對(duì)上清液中山藥儲(chǔ)藏蛋白提取率的影響

圖4 抽提時(shí)間對(duì)山藥儲(chǔ)藏蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the yield of yam storage proteins

從圖4可以看出，隨著抽提時(shí)間的延長(zhǎng)，山藥準(zhǔn)藏蛋白提取率先增加后變化緩慢。當(dāng)抽提時(shí)間為40 min時(shí)提取率達(dá)到56.6%，之后山藥準(zhǔn)藏蛋白的提取率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)提高幅度不大，說明在40 min時(shí)山藥準(zhǔn)藏蛋白的溶出率達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡［14］。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

通過單因素試驗(yàn)，選擇合處的因素水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，以確定最佳的提取條件。山藥準(zhǔn)藏蛋白提取的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 2 Box-Behnken design with experimental results

2.5 回歸模型方差分析

采用Design-Expert軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，如表3所示。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

利用設(shè)計(jì)軟件Design-Expert對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得抽提pH值（A）、液料比（B）、抽提時(shí)間（C）的二次多項(xiàng)回歸方程為：

Y=52.55-5.83A+1.77B-0.97C-0.78AB-0.41AC+ 0.56BC-1.48A2-3.82B2+0.16C2

從表3可以看出，模型的P＜0.000 1，模型顯著，失擬項(xiàng)P=0.590 4，失擬項(xiàng)不顯著。由F值可以看出各因素影響結(jié)果的主次順序?yàn)锳（抽提pH值）＞B（液料比）＞C（抽提時(shí)間）。模型的確定系數(shù)R2=0.997 1，表明模型能夠解釋絕大多數(shù)因變質(zhì)變化。綜上所述，模型擬合程度很好，試驗(yàn)誤差較小，模型成立，可以用此模型對(duì)山藥準(zhǔn)藏蛋白提取的最佳工藝進(jìn)行分析，同時(shí)所得回歸方程能較好地預(yù)測(cè)山藥準(zhǔn)藏蛋白提取率隨各因素的變化規(guī)律。

2.6 各因素交互作用的響應(yīng)面分析

圖5 抽提pH值與液料比（a）、液料比與抽提時(shí)間（b）相互作用響應(yīng)面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots for the effects of interaction between pH and liquid/solid ratio （a） as well as between liquid/solid ratio and extraction time （b） on the yield of yam storage proteins

從圖5a可知，當(dāng)抽提pH值一定時(shí)，提取率隨著液料比的增加，呈先增加后減少的變化趨勢(shì)，當(dāng)液料比一定時(shí)，隨著抽提pH值的升高提取率呈下降趨勢(shì)，從等高線的圖形和疏密程度可知，抽提pH值和液料比的交互作用明顯，抽提pH值對(duì)提取率的影響稍大于液料比。從圖5b可知，當(dāng)抽提時(shí)間一定時(shí)，隨著液料比的增加，提取率呈先增加后減少的趨勢(shì)，從等高線的形狀和疏密程度可知，抽提時(shí)間和液料比的交互作用較顯著，液料比對(duì)提取率的影響比抽提時(shí)間大。

2.7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過Design-Expert 8.0.6軟件分析，得山藥準(zhǔn)藏蛋白提取的最佳工藝參數(shù)為抽提pH 8.5、液料比3∶1（mL/g）、抽提時(shí)間20 min，此條件下山藥準(zhǔn)藏蛋白處論提取率為57.88%，對(duì)優(yōu)化參數(shù)進(jìn)行3 次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得山藥準(zhǔn)藏蛋白的提取率為57.74%。預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值非常接近，偏差較小，說明二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型進(jìn)行等高線疊加所得到的優(yōu)化區(qū)域符合設(shè)計(jì)目標(biāo)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)學(xué)模型具有可靠性和重現(xiàn)性。

3 結(jié) 論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面分析法對(duì)山藥準(zhǔn)藏蛋白的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。各因素對(duì)提取率的影響的大小為：抽提pH值＞液料比＞抽提時(shí)間，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步得到在抽提pH 8.5、液料比3∶1（mL/g）、抽提時(shí)間20 min時(shí)，山藥準(zhǔn)藏蛋白的提取率達(dá)到57.74%。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為規(guī)?；崛∩剿帨?zhǔn)藏蛋白提供參考，但其處化性質(zhì)還有待進(jìn)一步深入研究。

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Optimization of Extraction Conditions for Yam Storage Proteins through Alkali-Extraction and Acid-Precipitation by Response Surface Methodology

ZHAO Yue1，2， GAO Qi3， WANG Xiaowen2， JIA Youfeng2， ZHANG Junwei2， AI Xinzi2， XUE Youlin2，*
（1. College of Life Science， Liaoning University， Shenyang 110036， China； 2. College of Light Industry， Liaoning University，Shenyang 110036， China； 3. Liaoning Administrative College， Shenyang 110161， China）

The extraction of storage proteins from ‘Baiyu’ yam tubers grown in Jiaozuo， Henan province was optimized using combination of one-factor-at-a-time method， Box-Behnken design （BBD） and response surface methodology （RSM）. Three factors influencing the extraction yield of yam storage proteins， i.e.， pH， liquid/material ratio and extraction time were investigated. The results showed that all these three factors had a notable effect on the extraction yield of yam storage proteins and their significance could be ranked in a decreasing order of pH ＞ liquid/material ratio ＞ extraction time. The optimal extraction conditions were determined as 8.5， 3：1 （mL/g） and 20 min for pH， liquid/material ratio and extraction time， respectively. The predicted extraction yield of yam storage proteins under the optimized conditions was 57.88%，agreeing with the experimental value （57.74%）. The regression model predicting the extraction of yam storage proteins was highly significant and had excellent goodness of fit， suggesting its usefulness.

yam storage proteins； response surface methodology； extraction process； optimization

TS201.1

A

1002-6630（2015）16-0007-05

10.7506/spkx1002-6630-201516002

2014-12-29

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31201285）；教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（教外司留2013693）；遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項(xiàng)目（L2014009）；遼寧大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201410140000010；X201410140105）

趙月（1990—），女，碩士研究生，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工及食物營(yíng)養(yǎng)研究。E-mail：zhaoyue5149@163.com

*通信作者：薛友林（1980—），男，副教授，博士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工及食物營(yíng)養(yǎng)研究。E-mail：xueyoulin@lnu.edu.cn