1型糖尿病對小鼠早孕時期子宮肌層結(jié)構(gòu)和細(xì)胞增殖的影響

袁捷 姜云生 杜彥麗 王肅

·論著·

1型糖尿病對小鼠早孕時期子宮肌層結(jié)構(gòu)和細(xì)胞增殖的影響

袁捷 姜云生 杜彥麗 王肅

目的探討1型糖尿病對小鼠早孕子宮肌層結(jié)構(gòu)和細(xì)胞增殖的影響。方法實(shí)驗(yàn)中共有7周齡Balb/C雌性小鼠73只，雄性小鼠20只。利用隨機(jī)數(shù)字表法從雌性小鼠中隨機(jī)取45只于尾靜脈注射四氧嘧啶生理鹽水溶液誘導(dǎo)1型糖尿病，其余28只作為對照組。共成功誘導(dǎo)1型糖尿病小鼠模型30只，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法選擇28只作為糖尿病組。糖尿病組根據(jù)病程分為D1組(90～100 d)、D2組(101～110 d)。于孕168 h，取小鼠子宮肌層通過光鏡、電鏡下觀察組織學(xué)病理變化；用免疫組織化學(xué)方法檢測子宮肌層細(xì)胞增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá)。建模前、后檢測血糖、胰島素；觀察體重、飲水、飲食等。結(jié)果成功構(gòu)建了能自然交配并妊娠的糖尿病小鼠。與對照組相比，D1、D2組子宮內(nèi)、外肌層細(xì)胞的增殖指數(shù)都明顯降低(t=8.15，11.60,P均<0.001)。同時，D1組全肌層厚度及內(nèi)/外肌層間距均較對照組增大(t=2.12,4.40,P均<0.05)，而D2組全肌層厚度及內(nèi)/外肌層間距均較對照組明顯減小(t=19.93,15.15，P均<0.001)。D1組(t=2.25,3.46，P均<0.05)、D2組(t=3.46,10.28，P均<0.001)內(nèi)、外肌層厚度較對照組減小。D1與D2組的內(nèi)肌層和外肌層細(xì)胞的排列明顯打亂。結(jié)論糖尿病對小鼠早孕時期子宮肌層產(chǎn)生不良影響。

糖尿病；早孕；子宮肌層；增殖細(xì)胞核抗原

子宮肌層是一種高適應(yīng)性的特殊組織，在雌性動物的動情期和妊娠期均能有極大幅度的變化，以適應(yīng)胚胎的生長、胎盤的形成及成功分娩[1-2]。在此過程中，子宮平滑肌細(xì)胞的增生和肥大扮演著重要角色。子宮平滑肌的收縮是其主要功能之一，如控制子宮血液回流，為胎兒生長創(chuàng)造一個合適的空間等。

當(dāng)然，子宮收縮在胎兒分娩中也起著至關(guān)重要的作用[1]。研究顯示，1型糖尿病可影響妊娠，導(dǎo)致胎兒畸形、死胎和早產(chǎn)[2-4]。其可能原因是子宮內(nèi)膜和子宮平滑肌的收縮功能受到影響[5-7]。糖尿病引發(fā)的早產(chǎn)和血糖控制較差有關(guān)，其使早產(chǎn)率由24%上升到38%[8]。但是1型糖尿病影響妊娠的機(jī)制仍然不清楚。為此，本研究使用四氧嘧啶誘導(dǎo)的1型糖尿病模型小鼠，探索糖尿病在早期妊娠中對子宮平滑肌細(xì)胞增生的影響。

1 材料與方法

1.1 小鼠飼養(yǎng)及試劑 SPF級Balb/C小鼠購自武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，7周齡，體重30～32 g，雌性73只，雄性20只。實(shí)驗(yàn)前雌、雄分籠，經(jīng)預(yù)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周：即飼養(yǎng)于普通級動物房，恒定室溫(21℃)、濕度60%～80%和12 h/12 h光照/黑暗周期。提供潔凈飲水和小鼠全價復(fù)合飼料。

主要試劑與儀器包括：四氧嘧啶(用以誘導(dǎo)糖尿病模型，美國Sigma公司，25 g/瓶)、全自動血糖儀(日本京都Ⅱ型血糖儀，日本ARKRAY Inc公司)、全自動生化分析儀(Olympus-AU400型，日本奧林巴斯儀器公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組 利用隨機(jī)數(shù)字表法從雌性小鼠中取45只，禁食(不禁水)16 h，于尾靜脈注射四氧嘧啶生理鹽水溶液(150 mg四氧嘧啶溶于18 ml生理鹽水中)0.15 ml，含四氧嘧啶1.25 mg[即暴露劑量為四氧嘧啶40 mg/(kg·體重)]，每日1次，連續(xù)3 d[9]。繼續(xù)按預(yù)適應(yīng)條件飼養(yǎng)。7 d后于小鼠尾靜脈采血，分離血清后測血清葡萄糖水平。連續(xù)3 d檢測血清葡萄糖>22.22 mmol/L即為造模成功。共獲得糖尿病雌鼠30只。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法取28只為糖尿病組，繼續(xù)飼喂。根據(jù)糖尿病病程，將糖尿病組小鼠分為2個亞組:90～100 d為D1組;101～110 d為D2組，每個亞組10只。對照組：另外28只雌性小鼠為對照組。飼喂方法同糖尿病組，但僅注射生理鹽水0.15 ml，處理方法同上，檢測血清葡萄糖水平。另有雄性小鼠20只，同對照組飼喂方法，但不檢測血清葡萄糖水平。

1.2.2 小鼠交配實(shí)驗(yàn)及有關(guān)指標(biāo)檢測 糖尿病組和對照組從分組開始起，每30天從各組中處死2只，采樣檢測小鼠的血糖、血清胰島素、尿酮體、體重、食物和水的消耗量，用于判斷小鼠糖尿病狀態(tài)。各組均檢測4次，處死8只，最后兩組剩余20只分別與雄性小鼠進(jìn)行交配實(shí)驗(yàn)。

于小鼠接受四氧嘧啶或生理鹽水處理后90～110 d后給小鼠安排雌、雄小鼠合籠。根據(jù)Stumm和Zorn[10]的方法，糖尿病組和對照組小鼠每日和雄性小鼠合籠時間為3 h，3 h后檢查陰栓，以出現(xiàn)陰栓的時間為小鼠懷孕的0 h點(diǎn)。

1.2.3 組織收集 在懷孕168 h(子宮肌層適應(yīng)了妊娠的第一個階段)后采取脫頸法處死小鼠。處死前，小鼠腹腔注射Avertin(Sigma公司，美國)0.025 ml/(g·體重)。為防止子宮肌層的收縮，在切除子宮之前，給小鼠子宮內(nèi)滴入4%(W/V)罌粟堿。去除小鼠的消化道后稱取小鼠體重。

1.2.4 光鏡檢查 將各組小鼠的右側(cè)子宮角作為標(biāo)本，用乙醇∶氯仿∶冰醋酸(6∶3∶1)固定，4℃，3 h，然后用石蠟包埋，石蠟切片機(jī)切成5 μm厚度，沾于0.1%多聚甲醛包被的玻片，用于免疫組織化學(xué)染色檢測增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)及普通HE染色。

1.2.5 免疫組織化學(xué)方法檢測子宮平滑肌細(xì)胞PCNA 石蠟切片的標(biāo)本用3% H2O2-甲醇溶液處理30 min，山羊血清(含10%BSA的PBS=1∶1)封閉非特異性結(jié)合，然后用兔抗小鼠PCNA多克隆抗體(Abcam，1∶2 000)，4℃，過夜，加生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG(Rockland，1∶2 000)，37℃，1 h，用過氧化物酶結(jié)合的鏈霉素親和素孵育，37℃，1 h，繼而用含0.03%H2O2和0.03%二甲基聯(lián)苯胺的PBS孵育。用PBS代替一抗用做空白對照。

1.2.6 電鏡觀察 子宮角組織用含2%戊二醛和2%多聚甲醛的PBS固定，24 h，4℃，繼而用含1%四氧化鋨的PBS進(jìn)行浸泡2 h。然后對標(biāo)本進(jìn)行脫水，用樹脂進(jìn)行包被。用MT-2超薄切片機(jī)將標(biāo)本切成厚度為50 nm的薄片。用醋酸雙氧鈾對標(biāo)本染色，用枸櫞酸鹽處理后用JEOL100 CX2透射電鏡拍照。

1.2.7 組織形態(tài)確定和增殖指數(shù)評價 用尼康Eclipse E600顯微鏡配套DP72攝像機(jī)(Nikon, 日本)和Image Pro Plus software(Media Cybernetics, 美國)捕獲和分析結(jié)果。分析子宮肌層厚度時，每只小鼠至少分析10個視野，至少取子宮肌層5～10個部位進(jìn)行測量。增殖指數(shù)用PCNA的陽性率來反映，每組至少檢測1 000個細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠生理指標(biāo) 與對照組相比，糖尿病組小鼠表現(xiàn)為高血糖、尿糖、低胰島素、食物消耗增多、飲水增多但體重減輕，同時妊娠胚胎數(shù)明顯減少，見表1。

2.2 妊娠小鼠子宮肌層細(xì)胞的增殖情況 對妊娠早期小鼠的子宮肌層組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，反映PCNA的表達(dá)，不管是內(nèi)肌層還是外肌層，D1組和D2組均表現(xiàn)出細(xì)胞增殖減少，見圖1(封3)。同時D1組(t=8.15,10.97,P均<0.001)、D2組(t=11.29,11.60,P均<0.001)小鼠子宮內(nèi)、外肌層細(xì)胞的增殖指數(shù)都明顯低于對照組，見圖2。

2.3 糖尿病對子宮肌層組織結(jié)構(gòu)的影響 各組小鼠子宮肌層組織切片染色后在光鏡下拍照并分析全肌層厚度、內(nèi)/外肌層間距、內(nèi)肌層厚度、外肌層厚度等指標(biāo)，如圖3(封3)，D1組全肌層厚度及內(nèi)/外肌層間距均較對照組增大(t=2.12,4.40,P<均0.05)，而D2組全肌層厚度及內(nèi)/外肌層間距均較對照組明顯減小(t=19.93,15.15,P均<0.001)。D1組(t=2.25,t=3.46,P均<0.05)、D2組(t=3.46,10.28,P均<0.001)內(nèi)、外肌層厚度較對照組減小，見圖4。

表1 各組小鼠的生理指標(biāo)

注：a：組內(nèi)所有標(biāo)本測量結(jié)果低于檢測限

注：與對照組相比，aP<0.001；PCNA：增殖細(xì)胞核抗原圖2 各組子宮肌層細(xì)胞增殖指數(shù)

注：與對照組相比，aP<0.05,bP<0.001；與D1組相比，cP<0.001圖4 各組小鼠子宮全肌層、內(nèi)、外肌層厚度及間距比較

2.4 糖尿病對子宮平滑肌肌層超微結(jié)構(gòu)的影響 應(yīng)用電鏡對子宮平滑肌肌層超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，糖尿病組的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，主要表現(xiàn)為糖尿病組內(nèi)肌層和外肌層平滑肌細(xì)胞的排列規(guī)律性明顯打亂。而且在內(nèi)、外肌層連接層中發(fā)現(xiàn)大量的膠原纖維沉積，如圖5(封3)所示。

3 討論

糖尿病是一種非常嚴(yán)重的代謝性疾病，隨著人們生活水平的提高，糖尿病患者數(shù)量持續(xù)增長，其并發(fā)癥嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。不僅如此，目前糖尿病發(fā)病人群有年輕化的趨勢，其中育齡期女性患者不占少數(shù)，臨床總結(jié)發(fā)現(xiàn)，糖尿病女性患者妊娠后發(fā)生早產(chǎn)、死胎、胎兒畸形的概率明顯高于健康女性[3-5]。

糖尿病能引起多器官的疾病，包括泌尿生殖道、心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等[10-13]。子宮肌層在孕期發(fā)生的變化在大鼠內(nèi)分為4個時期，第1時期為早孕期，主要表現(xiàn)是子宮平滑肌細(xì)胞增生、肥大，第2時期為妊娠中期，子宮平滑肌細(xì)胞繼續(xù)增生、肥大，同時伴有細(xì)胞外基質(zhì)的合成增多，第3時期子宮平滑肌表現(xiàn)為收縮準(zhǔn)備階段，然后第4時期為分娩期，子宮平滑肌劇烈收縮，促成分娩的完成。Shynlova等[14]認(rèn)為這一系列的過程是因?yàn)閮?nèi)分泌信號以及胎兒生長將子宮平滑肌拉伸所致。

早期的一項(xiàng)研究表明，糖尿病小鼠的子宮重量減輕，其原因是既有子宮內(nèi)膜的萎縮，又有子宮肌層的萎縮[5]。且超微結(jié)構(gòu)檢查發(fā)現(xiàn)糖尿病導(dǎo)致子宮肌層的萎縮。子宮收縮是子宮的一個重要功能，Kaya等[6]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病能導(dǎo)致女性子宮的收縮功能減弱。Spiegl等[7]在動物研究中也觀察到同樣的現(xiàn)象。但是引起這些現(xiàn)象的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)還不是很清楚。

本文立足于妊娠早期糖尿病小鼠的子宮肌層改變，嘗試闡明糖尿病對妊娠早期的影響，利用的小鼠糖尿病模型表現(xiàn)為高血糖、尿糖、體重減輕、食物消耗和水消耗增多，且62%的小鼠血糖>22.22 mmol/L，表現(xiàn)為嚴(yán)重的糖尿病。

小鼠患糖尿病后其能否妊娠是一個值得考慮的問題，本研究的糖尿病模型小鼠在建模90～110 d后均能正常的交配且妊娠。鏈脲佐菌素也能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生糖尿病，但是研究發(fā)現(xiàn)注射鏈脲佐菌素8周后小鼠雖然患糖尿病，卻無法順利交配和維持妊娠狀態(tài)[15-16]。本研究結(jié)果說明糖尿病能夠促進(jìn)子宮肌層發(fā)生明顯的變化，該變化是時間依從性的，筆者觀察了誘導(dǎo)糖尿病50～60 d小鼠的子宮肌層，其結(jié)構(gòu)并沒有發(fā)生明顯變化(結(jié)果中未列出)。但是誘導(dǎo)糖尿病90～110 d小鼠的子宮肌層變化是有時間依賴性的。同樣在糖尿病小鼠組織中觀察到了水腫和膠原纖維沉積。因此認(rèn)為，妊娠早期血管通透性增加導(dǎo)致組織水腫，并增加子宮肌層之間的間距。本研究的一個重要發(fā)現(xiàn)是，糖尿病能夠影響子宮平滑肌細(xì)胞的排列，電鏡照片發(fā)現(xiàn)，平滑肌細(xì)胞的排列錯亂會直接打亂平滑肌有力的收縮功能。在糖尿病組，子宮肌層的細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷明顯減少，而細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷在平滑肌細(xì)胞的功能中發(fā)揮重要功能，如膜表面受體數(shù)量、離子通道數(shù)量調(diào)節(jié)。因此，細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷減少可能影響平滑肌的功能[17]。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，糖尿病能改變平滑肌層的排列和收縮功能，以及妊娠后子宮平滑肌的增殖，這些由糖尿病引發(fā)的病理變化改變了妊娠早期子宮平滑肌的功能，對患糖尿病的時間具有依從性。本研究為開展糖尿病患者子宮肌層研究提供了基礎(chǔ)，并為指導(dǎo)糖尿病患者妊娠提供了依據(jù)。

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Effectsoftype1diabetesonthemuscularisstructureandcellproliferationofuterineinmiceduringearlypregnancy

YuanJie，JiangYunsheng，DuYanli，WangSu.

DepartmentofEndocrinology,TheFifthCentralHospitalofTianjin,Tianjin300451,China

ObjectiveTo explore the effects of type 1 diabetes on uterine muscularis structure and cell proliferation in mice during early pregnancy.MethodsThere were 73 female and 20 male Balb/C mice at 7-week age in the test.Forty five female mice were selected according to random number table and injected with alloxan via tail vein to induce type 1 diabetes, and the remaining 28 mice were used as control group.Thirty type 1 diabetic mice were obtained, and 28 mice were selected according to random number table as diabetic group.Then all diabetic mice were divided into two group according to diabetic duration:D1 group(90-100 d) and D2 group(101-110 d) After pregnancy for 168 h,the changes of uterine muscle were examined by light microscope and electron microscope.Immunohistochemistry was used to detect the expression of proliferating cell nuclear antigen(PCNA) in myometrial cells.Blood glucose and insulin,water consumption,diet consumption,and weight were measured before and after the modeling.ResultsNatural mating and pregnant diabetic mice were successfully induced. Compared with control group, the cell proliferation of inner and outer muscular layer were significant decreased in D1 and D2 group(t=8.15-11.60, allP<0.001), the total thickness of the muscular layer, the spacing of inner and outer muscular layer were increased(t=2.12,4.40, allP<0.05) in D1 group,while the total thickness of the musclar layer and the spacing of inner and outer muscular layer was significantly decreased in D2 group(t=19.93,15.15, allP<0.001). Compared with control group, the thickness of inner muscular layer and outer muscular layer were also decreased in D1 group (t=2.25,3.46, allP<0.05) and D2 group (t=3.46,10.28,allP<0.001). And the ultrastructure of inner and outer muscular layer was also changed in D1 group and D2 group.ConclusionDiabetes could cause adverse effects to uterine muscular layer in early pregnant mice.

Diabetes mellitus;Early pregnancy;Myometrium;Proliferating cell nuclear antigen

(IntJEndocrinolMetab，2015，35：6-10)

10.3760/cma.j.issn.1673-4157.2015.01.002

300451 天津市第五中心醫(yī)院內(nèi)分泌科

2014-10-09)