單核細胞增生李斯特菌對秀麗隱桿線蟲致病性的研究

郭欣欣， 于新惠， 張 穎， 羅 勤

(華中師范大學生命科學學院 遺傳調(diào)控與整合生物學湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430079)

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單核細胞增生李斯特菌對秀麗隱桿線蟲致病性的研究

郭欣欣， 于新惠， 張 穎， 羅 勤*

(華中師范大學生命科學學院 遺傳調(diào)控與整合生物學湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430079)

單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，Lm)是李斯特菌病的病原細菌。用Lm野生株EGDe、弱毒株ΔprfA、毒力回復株+prfA和高毒株+prfA*喂飼模式生物秀麗隱桿線蟲N2，并以線蟲的良好食源大腸埃希菌OP50以及非致病的無害李斯特菌(Listeriainnocua)作為對照，檢測Lm對線蟲發(fā)育周期、壽命和產(chǎn)卵數(shù)的影響。結(jié)果顯示：當以無害李斯特菌、Lm野生株以及PrfA突變株為食時，線蟲的產(chǎn)卵數(shù)雖有所下降，但線蟲不僅能夠正常產(chǎn)卵，而且其發(fā)育周期和壽命均較以O(shè)P50為食時顯著延長(P≤0.05)；線蟲體表和消化道中均可檢測到大量李斯特菌，但糞便中的活菌數(shù)極少。以上結(jié)果說明Lm不能殺死秀麗隱桿線蟲，對線蟲也沒有顯著致病性，不適合作為研究Lm致病機制的模型；Lm可在線蟲體表和消化道存在，暗示Lm可借助線蟲在土壤環(huán)境中生存和傳播。

單核細胞增生李斯特菌；秀麗隱桿線蟲；PrfA；致病性；模型

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)是一種以細菌為食、自由生活的小型土壤線蟲。因其具有全身透明易于觀察、生命周期短、操作方便簡單、培養(yǎng)成本低廉、可操控性強等優(yōu)點，已成為應(yīng)用越來越廣泛的模式生物。用病原細菌喂飼線蟲，如果病原菌可以對線蟲致病，則線蟲可能作為研究病原菌致病機制的模型。目前該方面的研究已成功用于發(fā)現(xiàn)或確定金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、類鼻疽伯克霍爾德菌(Burkholderiapseudomallei)等細菌的毒力因子[1]，鼠傷寒沙門菌(Salmonellatyphimurium)與宿主相互作用關(guān)系，以及耐藥機制等多個方面。單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，以下簡稱Lm)是一種無芽胞兼性厭氧革蘭陽性菌，在自然界中廣泛分布, 土壤、污水、人和動物的糞便、飼料以及多種食品中均有該菌存在 。通過攝入被其污染的食物, 人和動物能罹患李斯特菌病(Listeriosis)，引起腦膜炎、骨髓炎、心肌炎、孕婦流產(chǎn)以及產(chǎn)褥感染等疾病，死亡率高達30%～70%，因此被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為關(guān)系食品衛(wèi)生安全的重要的食源性致病菌之一。PrfA (Positive regulatory factor A) 是Lm中調(diào)控絕大多數(shù)毒力基因轉(zhuǎn)錄表達的重要毒力因子，在細菌侵染宿主并導致疾病中起著至關(guān)重要的作用，缺失其編碼基因prfA將極大降低該菌的致病能力[2]。和其他病原細菌一樣，Lm對秀麗隱桿線蟲的致病能力也成為人們關(guān)注的焦點，然而迄今為止該方面的研究結(jié)果卻爭議巨大。一方面，Thomsen等[3]報道Lm能夠在線蟲腸道內(nèi)積累并殺死線蟲，而缺失了毒力因子PrfA 和DegU的突變株卻不能殺死線蟲，因此認為秀麗隱桿線蟲可以作為研究Lm毒力因子的模型；另一方面，Guha等[4]卻發(fā)現(xiàn)浮游狀態(tài)和生物被膜狀態(tài)的Lm均不能感染和殺死線蟲，線蟲不能成為研究Lm致病機制的模型。為了確證Lm對秀麗隱桿線蟲的致病作用，利用本實驗保存和構(gòu)建的無害李斯特菌(Listeriainnocua)標準株CLIP 11262和Lm標準野生株EGDe以及該菌衍生的3種PrfA突變株喂飼秀麗隱桿線蟲野生型N2，即：△prfA(缺失PrfA的編碼基因prfA，菌株毒力極大減弱[2])、+prfA(高拷貝回復野生型prfA基因到△prfA中, 菌株毒力恢復)、+prfA*(回復prfA的突變基因prfA*到△prfA中，使其PrfA蛋白組成性高表達，菌株毒力極大增強)，比較觀察線蟲發(fā)育周期、壽命、產(chǎn)卵數(shù)以及線蟲體表、消化道和糞便中細菌數(shù)的差異，從而探討線蟲是否適合作為研究Lm致病機制的模型。

1 材料與方法

1.1 線蟲、細菌及培養(yǎng)條件

秀麗隱桿線蟲野生型N2和大腸埃希菌 OP50由華中師范生命科學學院王國秀教授惠贈，OP50在NGM (Nematode growth medium)[5]液體培養(yǎng)中培養(yǎng)到OD600為0.6，取100 μL均勻涂布到NGM瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)至平板長滿細菌后，轉(zhuǎn)接線蟲到平板上，25 ℃進行培養(yǎng)。無害李斯特菌標準株CLIP 11262以及單核細胞增生李斯特菌標準株EGDe由德國維爾茨堡大學Werner Goebel教授惠贈，EGDe衍生的3種PrfA突變株由本實驗室構(gòu)建和保存[6]，EGDe和△prfA 采用BHI (Brain Heart Infusion, B&D公司) 培養(yǎng)基培養(yǎng)；+prfA 和+prfA*在含有20 μL/mL紅霉素的BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)。以上細菌在BHI液體培養(yǎng)中培養(yǎng)到OD600至0.6，取100 μL均勻涂布到BHI瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)至平板長滿細菌后，轉(zhuǎn)接線蟲到平板上，25 ℃繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2 線蟲的同步化

參照文獻[5]進行：首先在生長有OP50的線蟲NGM平板上大量培養(yǎng)線蟲，用M9緩沖液將線蟲沖于離心管中，清洗，加入裂解液。將裂解得到的蟲卵置于無OP50的NGM培養(yǎng)基中孵化。將孵化得到的L1期線蟲轉(zhuǎn)移到有OP50的NGM培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，從而獲得生長狀態(tài)一致的同步化的線蟲。

1.3 培養(yǎng)基和抗生素對線蟲生存曲線和壽命的影響

分別將10條同步化的L4期線蟲接入無菌、無抗生素的BHI平板或者添加20 μL/mL紅霉素(Amresco公司)的BHI平板，以及無菌NGM平板上，25 ℃培養(yǎng)，若線蟲對于觸碰無反應(yīng)則判斷線蟲死亡。每隔12 h觀察線蟲生活狀況，記錄存活線蟲的數(shù)目，計算線蟲存活率。以線蟲的存活率為縱坐標，觀察時間為橫坐標作圖，即為線蟲的生存曲線。線蟲壽命的測定方法見1.5, 喂飼菌苔為OP50，分別培養(yǎng)在BHI和NGM平板上。實驗重復3次。

1.4 線蟲發(fā)育周期的測定

方法參考Lin等[7]的報道，分別挑取10條同步化的L1期線蟲于生長有待檢細菌菌苔的平皿上，待卵產(chǎn)生后，收集大約20 顆卵分別置于新鮮培養(yǎng)基上，此時記為0 h。25 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后，每隔3 h觀察1次，直到新卵產(chǎn)生，記錄每條線蟲從卵孵化到成蟲再到產(chǎn)卵所需時間，即為線蟲的發(fā)育周期。不同細菌每次挑選10 只線蟲進行檢測, 實驗重復3次。

1.5 線蟲壽命的測定

參照Lin等[7]的方法，將同步化的L1期線蟲單個移入生長有待檢細菌的平板中，25 ℃培養(yǎng)，直至死亡。記錄線蟲從開始培養(yǎng)直到死亡所經(jīng)歷的時間，即線蟲的壽命。為保證有新鮮的食物，每3 d 將線蟲重新轉(zhuǎn)板, 所有在培養(yǎng)期間鉆入瓊脂和爬壁上死亡的線蟲都不計入結(jié)果。不同細菌每次挑選10只線蟲進行檢測, 實驗重復3次。

1.6 線蟲產(chǎn)卵數(shù)的測定

參照Brenner等[5]的方法進行：將同步化的L4期線蟲單個移入生長有待檢細菌的平板中，25 ℃培養(yǎng)，為保證有新鮮的食物，每24 h 將線蟲重新轉(zhuǎn)板。記錄每條線蟲的總產(chǎn)卵量。不同細菌每次挑選3只線蟲進行測定, 實驗重復3次。

1.7 線蟲體表細菌計數(shù)方法

參照Guha等[4]的方法進行：將同步化的線蟲分別在待檢細菌平板上培養(yǎng)至L4期，挑取10 條線蟲移入1.5 mL的離心管中，加入0.5 mL的M9緩沖液渦旋震蕩10 min后, 再靜置5 min使線蟲沉淀到管的底部，小心吸取100 μL上清液進行梯度稀釋。分別取100 μL梯度稀釋液涂布BHI平板，每個稀釋濃度涂布3個平板，37 ℃過夜培養(yǎng)，記錄平板上生長的細菌個數(shù)。每組實驗重復3次。

1.8 線蟲消化道細菌計數(shù)方法

參照Guha等[4]的方法進行：分別挑取20 只在待檢細菌平板上培養(yǎng)傳了3代的L4期線蟲，置于含有60 μg/mL慶大霉素的LB平板上，25 ℃繼續(xù)培養(yǎng)1 h殺死線蟲體表的細菌后，將線蟲移入1.5 mL離心管，用M9緩沖液渦旋振蕩洗滌線蟲。將洗滌過的線蟲置于新的離心管中，加入0.5 mL M9緩沖液和100 mg石英砂，劇烈渦旋振蕩5 min裂解線蟲，裂解后進行梯度稀釋，吸取100 μL梯度稀釋液涂布BHI平板，每個稀釋濃度涂布3個平板，37 ℃過夜培養(yǎng)，記錄平板上細菌克隆個數(shù)。每組實驗重復3次。

1.9 線蟲糞便細菌計數(shù)

參照Guha等[4]的方法進行：分別挑取10 只在待檢細菌平板上培養(yǎng)傳了3代的L4期線蟲，用含有60 μg/mL慶大霉素的M9緩沖液充分洗滌線蟲，以除去線蟲體表殘余的細菌。然后將線蟲轉(zhuǎn)移到無菌BHI平板上繼續(xù)培養(yǎng)3 h后，移走線蟲，將平板置于37 ℃過夜培養(yǎng)，記錄平板上產(chǎn)生的細菌個數(shù)。每組實驗重復3次。

1.10 線蟲對食物的趨向性

取50 μL大腸埃希菌OP50、EGDe、△prfA、+prfA和+prfA*(OD600=0.6左右)分別均勻滴加到BHI固體培養(yǎng)基上5個與中心點等距離的區(qū)域，37 ℃過夜培養(yǎng)。轉(zhuǎn)移100 條同步化的L2期線蟲于培養(yǎng)基中心，25 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，記錄移動到各種菌上的線蟲數(shù)量，連續(xù)觀察12 h。實驗重復3次。

1.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)采用Origin 7.0 進行統(tǒng)計分析。顯著性檢驗采用Student’s t-tests 方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基和抗生素對線蟲生存曲線和壽命的影響

盡管Lm在自然界分布廣泛，能夠在包括高鹽、低溫和低pH等逆境中生存, 但Lm在常用細菌培養(yǎng)基Luria-Bertani(LB)上生長緩慢，也不能在常用的線蟲培養(yǎng)基NGM上生長(數(shù)據(jù)未顯示)。實驗室通常使用營養(yǎng)豐富的腦心浸液BHI培養(yǎng)基培養(yǎng)李斯特菌。同時，因為LmEGDe毒力調(diào)控蛋白PrfA缺失回復株+prfA 和PrfA組成性高表達突變株+prfA*中具有表達PrfA蛋白的質(zhì)粒，培養(yǎng)這兩株細菌需要添加20 μL/mL紅霉素，然而，尚未見文獻明確闡述BHI培養(yǎng)基以及紅霉素對線蟲的影響，因此，在研究檢測Lm對秀麗隱桿線蟲的致病能力之前，有必要事先排除培養(yǎng)李斯特菌的BHI培養(yǎng)基以及紅霉素對線蟲生存能力的影響。如圖1所示：L4期線蟲在無菌的BHI平板上的生存時間與在無菌的NGM平板上相同，均為13 d；添加20 μL/mL的紅霉素不影響線蟲在BHI平板上的生存；而且從生存曲線來看， BHI平板還略微提高了線蟲在生命中后期(第6到12天)的生存率。同時，當以大腸埃希菌OP50為食源時，線蟲在BHI和NGM平板上的壽命分別是15.2和15.5 d(參見2.2.1結(jié)果)，也沒有顯著變化。以上實驗表明：BHI培養(yǎng)基和濃度為20 μL/mL的紅霉素不影響線蟲的生存和壽命，在后續(xù)實驗中可以忽略BHI培養(yǎng)基以及紅霉素對線蟲的作用。

圖1 培養(yǎng)基和抗生素對線蟲生存時間的影響Fig.1 The survival curves of C. elegans on NGM and BHI plates with (BHI with Em) or without 20 μL/mL of erythromycin

2.2 單核細胞增生李斯特菌對線蟲的致病能力

無害李斯特菌(L.innocua)的基因組與單核細胞增生李斯特菌的基因組具有高度的保守性和共線性，但因其不具有PrfA以及相關(guān)毒力因子，對人畜無致病能力[8]。本實驗在使用大腸埃希菌OP50作為參照的同時，也選擇了無害李斯特菌作為實驗對照，比較研究了Lm野生株EGDe及其3種PrfA突變株(即弱毒力株△prfA、毒力回復株+prfA和高毒株+prfA*)對線蟲發(fā)育周期、壽命和產(chǎn)卵數(shù)的影響，從而確定Lm對線蟲是否有致病作用。

2.2.1 單核細胞增生李斯特菌和無害李斯特菌對線蟲發(fā)育周期、壽命和產(chǎn)卵數(shù)的影響 如表1，當以無害李斯特菌、Lm野生株以及PrfA突變株為食時，線蟲不僅能夠正常產(chǎn)卵，而且其發(fā)育周期和壽命均較以O(shè)P50為食時顯著延長(P≤0.05)，特別是高毒株+prfA*有極顯著的延長作用(P≤0.01)；線蟲的產(chǎn)卵數(shù)雖有不同程度降低，但以各種李斯特菌為食時，均能正常產(chǎn)卵，而且，Lm野生株和無害李斯特菌對線蟲產(chǎn)卵數(shù)的影響并不顯著(P>0.05)，但弱毒株△prfA和高毒株+prfA*卻顯著降低了產(chǎn)卵數(shù)(P≤0.05)；更為重要的是，本實驗所使用的Lm野生株和PrfA突變株(弱毒力株△prfA、毒力回復株+prfA和高毒株+prfA*)均是文獻報道并被確認的具有顯著毒性差異的Lm菌株，但這些菌株對線蟲發(fā)育周期、壽命和產(chǎn)卵數(shù)的作用趨勢完全一致，表明李斯特菌毒力基因的不同表達對線蟲沒有顯著差異作用，線蟲不是研究單核細胞增生李斯特菌致病機制的良好模型。

表1 單核細胞增生李斯特菌和無害李斯特菌對線蟲發(fā)育周期、壽命和產(chǎn)卵數(shù)的影響

注：a、b表示與用大腸埃希菌OP50喂飼的線蟲相比，無害李斯特菌和4種單核細胞增生李斯特菌喂飼的線蟲在發(fā)育周期、壽命和產(chǎn)卵數(shù)方面的差異顯著性，其中a≤ 0.05，b≤ 0.01；c、 d表示用△prfA、+prfA和+prfA*喂飼的線蟲相對于野生株EGDe喂飼的線蟲在發(fā)育周期、壽命和產(chǎn)卵數(shù)方面的差異顯著性，其中c≤ 0.05, d≤ 0.01

2.2.2 線蟲蟲齡對單核細胞增生李斯特菌致病性的影響 在以線蟲為模型研究病原細菌致病性的實驗中，通常采用L4期線蟲。因為L4期線蟲處于線蟲發(fā)育生命周期的晚期，其免疫能力可能較弱，易受致病菌的感染[4]。為了檢驗蟲齡是否影響李斯特菌的致病能力，比較了Lm野生株EGDe和高毒力突變株+prfA*喂飼L4期和L2期線蟲時生存曲線的差異。如圖2所示，無論是以EGDe還是以+prfA*為食，處于發(fā)育周期中期的L2期線蟲的生存時間均比L4期線蟲略長，生存率增加，說明線蟲的蟲齡對線蟲的生存長短有重要影響。但是，高毒力的+prfA*喂飼L4期線蟲時的生存率卻明顯比野生株EGDe喂飼L2期線蟲時要高，表明高毒力的Lm不能破壞線蟲的免疫機制，單核細胞增生李斯特菌的毒性高低與線蟲蟲齡大小沒有相關(guān)性，線蟲蟲齡對李斯特菌的致病能力沒有影響。

圖2 單核細胞增生李斯特菌EGDe和+prfA*喂飼L4期和L2期線蟲時的生存曲線Fig.2 The survival curves of middle-aged (L2) and elderly worms (L4) fed on L. monocytogenes EGDe and +prfA*

2.2.3 單核細胞增生李斯特菌喂飼線蟲時，線蟲體表、消化道和糞便中的細菌數(shù) 研究表明，當用大腸埃希菌OP50喂飼線蟲時，OP50首先被線蟲咽的表皮結(jié)構(gòu)磨碎后吞食，線蟲的腸內(nèi)看不到完整的大腸埃希菌，也不能在線蟲的消化道檢出完整的細菌[1]。盡管以上實驗表明Lm不能致死線蟲，甚至能顯著延長線蟲的發(fā)育周期和壽命，但Lm與線蟲的相互關(guān)系，以及Lm能否作為線蟲的良好食源且被線蟲消化完全，還需進一步實驗。

表2 單核細胞增生李斯特菌喂飼線蟲時，線蟲體表、消化道和糞便中的細菌數(shù)

注：a、b表示與野生型EGDe相比，用△prfA和+prfA*喂飼線蟲時，線蟲體表、消化道和糞便中細菌數(shù)的差異顯著性，其中a≤ 0.05，b≤ 0.01

如表2所示，當用Lm野生株EGDe、弱毒株△prfA和高毒力突變株+prfA*喂飼線蟲后，從線蟲體表可以發(fā)現(xiàn)大量的細菌，其中以+prfA*最多，而△prfA最少；當經(jīng)過60 μg/mL慶大霉素的充分處理，去掉了未被攝食的體表李斯特菌后，從線蟲消化道中仍然可以檢出大量活細菌，其中EGDe的數(shù)量最多，而+prfA*最少；但當與線蟲體表和消化道中檢出的活菌數(shù)相比，線蟲糞便活細菌數(shù)大為減少。以上結(jié)果表明：線蟲能夠以Lm為食；Lm被線蟲攝食后，并不被立即完全消化，可以在線蟲消化腸道中存活一段時間；Lm毒性強弱與在線蟲體表和消化腸道的生存沒有相關(guān)性。

3 討 論

在人類病原細菌致病機制的基礎(chǔ)研究中，選擇合適的模式宿主至關(guān)重要。近年來，秀麗隱桿線蟲以其背景資料豐富、便于操作和觀察、廉價等特點，成為研究者關(guān)注的熱點，但唯有病原菌可以對線蟲致病，線蟲才有可能作為研究病原菌致病性的模型。本實驗以秀麗隱桿線蟲N2的良好食源大腸埃希菌OP50以及無害李斯特菌為參照，比較研究了食源性致病菌單核細胞增生李斯特菌EGDe及其毒力調(diào)控蛋白PrfA突變株對秀麗隱桿線蟲N2的致病作用。研究發(fā)現(xiàn)與無害李斯特菌一樣，Lm及其PrfA突變株不僅不能使線蟲死亡，而且還能顯著延長線蟲的發(fā)育周期和壽命，這在一定程度上暗示Lm對秀麗隱桿線蟲沒有顯著致病性，不適合作為研究Lm致病機制的模型。

Lm對秀麗隱桿線蟲非致死性，是否是因為培養(yǎng)線蟲的溫度(25 ℃)不適合Lm毒力基因的表達？已知的研究證明，Lm在環(huán)境溫度低于30 ℃時侵染能力較低， 可能是因為從prfA 啟動子P1轉(zhuǎn)錄合成的mRNA非翻譯5′端 (untranslated 5′-region)在溫度低于30 ℃時，能折疊形成二級結(jié)構(gòu), 掩蓋了核糖體結(jié)點，從而阻礙PrfA的合成；而在溫度高于30 ℃時，不能形成二級結(jié)構(gòu)，PrfA能夠順利合成，這就是所謂的“核糖體開關(guān)機制”[9]。該發(fā)現(xiàn)能夠解釋Lm毒力基因在自然界和感染宿主后差異表達的現(xiàn)象。即：當Lm在土壤環(huán)境(一般為室溫25 ℃左右)中以腐爛的植物為營養(yǎng)進行腐生生活時，毒力基因表達量較低；而當Lm侵染入人體細胞后(一般為37 ℃)，毒力基因表達大大提高。然而，盡管Lm主要的危害是造成人和牲畜的李斯特菌病，但該菌還能侵染大蠟螟和果蠅等生活環(huán)境溫度通常在30 ℃以下的昆蟲及其細胞系，暗示：“核糖體開關(guān)機制”不能完全詮釋Lm毒力基因表達調(diào)控的機制，溫度不是影響Lm對秀麗隱桿線蟲非致死性的唯一原因。

另外，研究發(fā)現(xiàn)，改變PrfA蛋白鏈上的關(guān)鍵氨基酸的組成也可以影響PrfA的活性，進而增強或者降低依賴PrfA調(diào)控的毒力基因的表達。本實驗中所采用的PrfA突變株+prfA*就是PrfA上第145位的甘氨酸替換為絲氨酸后產(chǎn)生的突變株，該突變極大地增強了PrfA與靶DNA的結(jié)合能力，導致PrfA的活性不再受溫度等培養(yǎng)條件的影響，使PrfA蛋白組成性高表達[9]，從而大大提高了突變株的致病能力。然而，本研究結(jié)果卻顯示，+prfA*和Lm野生株以及PrfA缺失株一樣，不僅不能造成秀麗隱桿線蟲死亡，反而能極其顯著地延長線蟲的發(fā)育周期和壽命，說明這些在動物毒理實驗中已知高毒性的Lm菌株對線蟲沒有顯著致病性，再次證明了線蟲不是研究單核細胞增生李斯特菌致病機制的良好模型。

實驗中發(fā)現(xiàn)可以從線蟲消化道檢出大量活Lm細菌，而在糞便中檢出的活菌極少，表明線蟲可以以Lm為食，但與線蟲的良好食源大腸埃希菌OP50不同，Lm被線蟲攝食后，似乎并不被立即磨碎消化，而能在消化道存活一段時間，直到被完全消化而排出細胞殘渣，暗示Lm并不是線蟲的良好食源，這也與本研究觀察到的線蟲喜食大腸埃希菌OP50的結(jié)果一致(移動到OP50的線蟲數(shù)目大約是移動到李斯特菌的線蟲數(shù)目的6倍)。因此，當線蟲以Lm為唯一食源時，線蟲可能因不喜食用李斯特菌而處于一定程度的饑餓狀態(tài)，而這種饑餓狀態(tài)已被證明可以延長線蟲的發(fā)育周期和壽命[10]。同時，由于Lm和線蟲均能在土壤環(huán)境中廣泛存在，Lm對線蟲的非致死性，也可能有助于Lm借助線蟲在土壤環(huán)境中生存和傳播。因此，鑒于Lm在食品衛(wèi)生安全中的重要影響以及線蟲在模式生物研究中的作用，進一步深入研究線蟲與Lm的相互關(guān)系將對解析食源性致病微生物在自然環(huán)境中的進化和傳播機制具有重要意義。

[1] 徐冬蕾, 闞飆. 秀麗隱桿線蟲作為研究病原細菌致病機制的新模型[J]. 中國媒介生物學及控制雜志, 2010, 21(3): 283-285.

[3] Thomsen LE, Slutz SS, Tan MW, et al.Caenorhabditiselegansis a model host forListeriamonocytogenes[J]. Applied and environmental microbiology. 2006, 72(2): 1700-1701.

[4] Guha S, Klees M, Wang X, et al. Influence of planktonic and sessileListeriamonocytogenesonCaenorhabditiselegans[J]. Archives of microbiology, 2013, 195(1): 19-26.

[5] Brenner S. The genetics ofCaenorhabdztzselegans[J]. Genetics, 1974, 77(1): 71-94.

[6] 馮飛飛, 張強, 王莉, 等. 毒力基因調(diào)控蛋白 PrfA促進單核細胞增生李斯特菌生物被膜的形成[J]. 微生物學通報, 2011, 38(9): 1450-1457.

[7] Lin YT, Hoang H, Hsieh SI, et al. Manganousion supplementation accelerates wild type development, enhances stress resistance, and rescues the life span of a short-livedCaenorhabditiselegansmutant[J]. Free radical biology and medicine, 2006, 40(7): 1185-1193.

[9] 羅勤, 張曉莉, 李兵, 等. 單核細胞增生李斯特菌PrfA蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)控毒力基因表達的分子機制[J]. 微生物學通報, 2008, 35(2): 275-280.

[10]沈露露,王大勇.秀麗線蟲衰老調(diào)控的生理與分子機制[J].生理科學進展,2009,40(1):75-78.

Pathogenicity of Listeria monocytogenes against Caenorhabditis elegans

GUO Xin-xin, YU Xin-hui, ZHANG Ying, LUO Qin

(HubeiKeyLab.ofGen.Regulat’n&Integrat.Biol.,Coll.ofLifeSci.,Cent.ChinaNormalUni.,Wuhan430079)

Listeriamonocytogenes(Lm) is a pathogenic bacterium of listeriosis. In this study wild type ofLmEGDe, attenuated strain ΔprfA, PrfA complementary strain +prfA, and a highly virulent strain +prfA*were fed respectively to model organism ofCaenorhabditiselegans(Ce) N2, at the same time, fine food resource ofE.coliOP50 and non-pathogenic and unharmfulL.innocuawas also fed to the model of Ce as a control, to determine the effect ofLmon the development circle, life-span and brood ofC.elegans. The results showed that when fed on unharmfulL.innocua, wild-typeLmEGDe and its PrfA mutant strains, although the brood was slightly decreased, however, the nematode not only could normally oviposit, but also the development period and life-span ofC.eleganswere significantly extended (P≤0.05) as compared with those fed onE.coliOP50. Furthermore, a large number of liveLmcells were detected from the worms’ surface and digestive tract, but only a few bacteria were detected in the worms’ excrements. The above results indicated thatLmneither can kill Ce nor have significant pathogenicity against Ce, therefore,C.elegansis not a suitable model to study Listeria pathogenicity.C.eleganscan exist inLmbody surface and digestive tracts, suggested thatLmcould exist and spreading in soil environment with the aid of nematode.

Listeriamonocytogenes;Caenorhabditiselegans; PrfA; Pathogenicity; model system

國家自然科學基金項目(30970111，31571931)

郭欣欣 女，碩士研究生。主要研究方向為微生物分子生物學。E-mail:939209685@qq.com

* 通訊作者。女，博士，副教授，碩士研究生導師。主要研究方向為病原微生物。Tel: 027-67867221，E-mail:qinluo@mail.ccnu.edu.cn

2014-06-16；

2014-09-04

Q939.96

A

1005-7021(2015)04-0007-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.04.002