桑椹果醋體外抗腫瘤活性的研究

王儲炎，方 銀，鄧永進，桂仲爭，葛遠飛

（1.合肥學院生物與環(huán)境工程系，安徽合肥230601；2.中國農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)研究所，江蘇鎮(zhèn)江212003；3.安徽省農(nóng)業(yè)科學院蠶桑研究所，安徽合肥230061）

桑椹果醋體外抗腫瘤活性的研究

王儲炎1，2，方 銀2，鄧永進3，桂仲爭2，葛遠飛1

（1.合肥學院生物與環(huán)境工程系，安徽合肥230601；2.中國農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)研究所，江蘇鎮(zhèn)江212003；3.安徽省農(nóng)業(yè)科學院蠶桑研究所，安徽合肥230061）

采用3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）比色法來測定桑椹果醋的體外抗腫瘤效果，并進行細胞形態(tài)學觀察。結(jié)果顯示，桑椹果醋具有較強的抗腫瘤活性，并且隨著桑椹果醋含量的增加，其抑制活性增大。細胞形態(tài)學觀察結(jié)果表明，在桑椹果醋作用下，人肝癌細胞系SMMC-7721和宮頸癌細胞Hela兩種腫瘤細胞均呈現(xiàn)數(shù)量減少、細胞膜加深變暗、成群聚在一起等不規(guī)則的生長趨勢，表明桑椹果醋對兩腫瘤細胞有較強的抑制作用。結(jié)果表明，桑椹果醋對Hela細胞的抑制效果強于SMMC-7721細胞。關(guān)鍵詞：桑椹果醋；抗腫瘤；形態(tài)學觀察

桑椹（Fructus mori）又名桑果，是?？粕僦参锍墒旃氲慕y(tǒng)稱，桑椹形狀呈橢圓或長形，一般顏色為紅色或黑色，也有的桑椹果實為白色。早期桑椹為養(yǎng)蠶業(yè)的副產(chǎn)品[1]，近年來隨著各地果桑品種的推廣，桑椹資源也越來越多。桑椹作為藥食同源的食品，中醫(yī)認為桑椹藥性溫和，有補肝益氣、養(yǎng)血生津、安神烏發(fā)、聰耳明目等功效，常用來治療貧血、神經(jīng)衰弱、失眠、津液缺乏、頭昏目眩、便秘、頭發(fā)早白、心臟病、風濕性關(guān)節(jié)炎、支氣管炎等疾病[2]。現(xiàn)代研究認為桑椹含有豐富的生物活性物質(zhì)，如脫氧野尻霉素、花青素、白藜蘆醇、類黃酮、多糖、維生素等，醫(yī)學證實桑椹具有降血糖、降血脂、抗衰老、增強免疫力等功效[3-4]。

桑椹果醋是以桑椹作為原料，經(jīng)酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵而成的營養(yǎng)豐富、風味優(yōu)良的酸性調(diào)味品。果醋不僅在營養(yǎng)、風味、口感上優(yōu)于傳統(tǒng)食醋，而且富集了桑椹自身的活性物質(zhì)，有效地提高了果醋的保健功能。目前對桑椹果醋的研究集中在釀造工藝和風味物質(zhì)的研究方面[5-8]，關(guān)于功能特性的研究報道主要是抗氧化和降血脂方面[9-10]，而對其抗腫瘤方面少見報道。本研究采用3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（methyl thiazoyl terazolium，MTT）比色法來測定桑椹果醋對SMMC-7721和Hela兩種腫瘤細胞的抑制情況，并進行細胞形態(tài)學觀察，希望通過此研究為桑椹果醋產(chǎn)品的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑椹由安徽省農(nóng)科院蠶桑研究所提供；釀酒高活性干酵母（Saccharomyces cerevisiae）：湖北安琪酵母有限公司；醋酸菌（Acetobacter pasteurianus）江蘇恒順醬醋廠醋醅。

人肝癌細胞系SMMC-7721、宮頸癌細胞Hela：大連生物技術(shù)研究所。二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：天津科密歐試劑公司；染色劑四甲基偶唑藍（MTT）：美國Fluka公司；RPM I-1640培養(yǎng)液、胎牛血清：美國GIBCO公司；RPM I-1640培養(yǎng)基由1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基和10%胎牛血清組成。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C精密pH計：上海精密科學儀器公司；SHZ-88A往復式水浴恒溫振蕩器：太倉市實驗設(shè)備廠；EL310型酶標儀：美國Bio-Tek公司；310型CO2培養(yǎng)箱：德國Thermo公司；Coulter Epics-XL流式細胞儀：美國庫爾特公司；DM I4000B倒置熒光顯微鏡：德國Leica公司；96孔細胞培養(yǎng)板：上海圣納堡生物科技開發(fā)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 桑椹果醋的制備

桑椹→原料處理→破碎分離→桑椹果汁→成分調(diào)整→酒精發(fā)酵→醋酸發(fā)酵→巴氏殺菌→桑椹果醋

1.3.2 操作要點

原料處理：選擇7成熟的桑椹作為原料，將腐敗變質(zhì)的桑椹及混入雜質(zhì)揀出來。

破碎分離：用果汁破碎機對桑椹進行破碎，過濾掉桑椹果渣，利用桑椹果汁進行發(fā)酵。

成分調(diào)整：包括糖、酸的調(diào)整和添加SO2。

酒精發(fā)酵[11]：將安琪釀酒活性干酵母按1∶20（g∶m L）的比例加入含有2%葡萄糖的溶液中，于40℃條件下活化15～20 min，再冷卻活化1～2 h。然后桑椹果汁中接種酵母菌1%，在溫度30℃的情況下，發(fā)酵6 d。

醋酸發(fā)酵：在酒精度為7.5%vol的桑椹果酒中，接種醋酸菌10%，于溫度32℃、轉(zhuǎn)速為160 r/min的條件下，發(fā)酵8～10 d即可。

巴氏殺菌：在70～80℃溫度下，殺菌15～20 min。

桑椹果醋：釀成的果醋可溶性固形物含量16 g/L，總酸為4.98 g/100 m L[7]。

1.3.3 細胞培養(yǎng)

將SMMC-7721、Hela兩種腫瘤細胞培養(yǎng)于RPM I-1640培養(yǎng)基中，要求箱內(nèi)CO2濃度為5%，環(huán)境濕潤，培養(yǎng)溫度為37±0.5℃，48 h換液一次，約96 h傳代一次[12]。

1.3.4 桑椹果醋體外抗腫瘤活性的測定

MTT比色法全名為3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽比色法，原理是活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚，并沉積在細胞中，相對地死細胞無此功能，因此可通過比色法檢測活細胞的數(shù)量，來驗證抗腫瘤的活性。SMMC-7721細胞是引起人肝癌的惡性腫瘤細胞，其易于傳代、成活率高，成為目前抗腫瘤和藥物毒理學方面的主要研究對象[13-14]。Hela細胞是子宮頸癌的癌細胞，其細胞株增殖異常迅速，能夠無限分裂，而且不會衰老致死[15]。因此，本試驗利用MTT法檢來測桑椹果醋對這兩種典型細胞的抑制效果。試驗步驟如下[16-19]：將對數(shù)生長期的SMMC-7721、Hela細胞分別配成濃度為1×105個/m L的細胞液，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入200 μL，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，待SMMC-7721和Hela細胞貼壁后分別加入果醋樣品0.2 μL、0.5 μL、0.8 μL、1.0 μL、1.5 μL、2.0 μL，同時將空白孔調(diào)零，無菌蒸餾水作為陰性對照，每個處理設(shè)置3個平行，然后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，每孔加入5 mg/m L MTT 20 μL。繼續(xù)孵育4 h后，每孔加入150 μL二甲基亞砜溶解，室溫振蕩10 m in，用酶標儀測定490 nm波長處的吸光度值，按如下公式計算細胞生長抑制率。

式中：OD0為空白組的吸光度值，OD1為加樣品組的吸光度值，OD2為陰性對照組的吸光度值。

1.3.5 細胞形態(tài)學觀察

根據(jù)前期試驗結(jié)果，為了更好地觀察腫瘤細胞生長形態(tài)的變化，選擇對SMMC-7721、Hela兩種腫瘤細胞培養(yǎng)板中注入1.0 μL果醋樣品，然后在37℃下培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，用倒置熒光顯微鏡進行形態(tài)學觀察，同時設(shè)無樣品的培養(yǎng)液處理組為對照組[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑椹果醋抗腫瘤活性分析

圖1為桑椹果醋對SMMC-7721細胞和Hela細胞抗腫瘤活性的抑制情況。

圖1 桑椹果醋對SMMC-7721細胞(A)和Hela細胞(B)的抑制作用Fig.1 The inhibitory effect of mulberry fruit vinegar on SMMC-7721 cell(A)and Hela cell(B)growth

由圖1可知，隨著桑椹果醋添加量的增大，SMMC-7721細胞和Hela細胞活性受到抑制也在逐漸增加；伴隨時間的延長，桑椹果醋對兩種腫瘤細胞的抑制率也在增加，同時在一定時間內(nèi)，抑制率呈明顯的時間劑量依賴性。當選取2.0 μL和1.5 μL果醋樣品來做抗腫瘤試驗時，72 h時桑椹果醋對SMMC-7721細胞的抑制率分別為61.24%和55.36%，對Hela細胞的抑制率則分別達到71.03%和59.62%。從細胞抑制率大小比較可看出，果醋對Hela細胞的抑制率稍高于SMMC-7721細胞。

2.2 果醋作用后細胞形態(tài)差異

圖2 桑椹果醋不同作用時間下的SMMC-7721細胞形態(tài)Fig.2 Morphology of SMMC-7721 cells treated by mulberry fruit vinegar under different time

圖3 桑椹果醋不同作用時間下的Hela細胞形態(tài)比較Fig.3 Morphology of Hela cells treated by mulberry fruit vinegar under different time

桑椹果醋作用前后SMMC-7721細胞和Hela細胞的形態(tài)變化情況分別見圖2和圖3。由圖2和圖3可知，倒置顯微鏡下觀察，兩種腫瘤細胞空白組生長良好，且呈梭形貼壁生長，大小均一，細胞分裂生長較快，比較透明，而且隨著時間延長，細胞長勢越好，72 h時腫瘤細胞密度大，基本布滿了整個培養(yǎng)板。相比在1.0 μL果醋作用下，用藥組細胞增殖緩慢，細胞膜加深、變暗，細胞呈現(xiàn)不規(guī)則的生長趨勢，大部分細胞為了存活，成群地聚合在一起，尤其72 h時腫瘤細胞的生長態(tài)勢明顯差于空白組，說明桑椹果醋對腫瘤細胞有一定的抑制作用，嚴重影響其增長繁殖。

3 結(jié)論

試驗結(jié)果證實，桑椹果醋對SMMC-7721細胞和Hela細胞具有較強的抑制作用，且隨著果醋添加量的增加或作用時間的延長，其抑制率隨之增加。形態(tài)學觀察表明，在桑椹果醋的作用下，SMMC-7721和Hela兩種腫瘤細胞均呈現(xiàn)數(shù)量減少、細胞膜加深變暗、成群聚在一起等不規(guī)則的生長趨勢，伴隨時間的延長，個別細胞甚至融合在一起，這些體現(xiàn)了桑椹果醋能夠抑制這兩種腫瘤細胞的生長，干擾其增長繁殖，因而起到抑制作用。但是，桑椹果醋為什么會對腫瘤細胞有如此強的抑制作用，其抑制機理和量效關(guān)系如何，值得進一步研究。本試驗結(jié)果對于桑椹果醋產(chǎn)品的開發(fā)將會有非常積極的現(xiàn)實意義。

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《中國釀造》雜志征稿啟事

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In vitro antitumor activity of mulberry fruit vinegar

WANG Chuyan1,2,FANG Yin2,DENG Yongjin3,GUI Zhongzheng2,GE Yuanfei1
(1.Department of Biological and Environmental Engineering,Hefei University,Hefei 230601,China; 2.Sericultrual Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Zhenjiang 212003,China; 3.Sericultural Research Institute,Anhui Academy of Agricultural Sciences,Hefei 230061,China)

The in vitro antitumor activity of mulberry fruit vinegar was investigated by MTT method,and the morphology of cells was observed.The results indicated that mulberry fruit vinegar possessed higher antitumor activity,and the inhibitory activity heightened with the increase of mulberry vinegar concentration.The morphological observation results indicated that under the effect of mulberry fruit vinegar,both SMMC-7721 cells and Hela cells were decreased and clustered together,cell membrane was deepened,dimmed and presented irregular development trend.The com parison showed that mulberry fruit vinegar had stronger inhibitory effect on Hela cells than SMCC-7721 cells.

mulberry fruit vinegar;antitumor activity;morphological observation

TS264.22

A

0254-5071（2015）03-0098-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.023

2015-03-09

合肥學院人才科研基金項目（14RC03）；2014年中德學者短期合作交流項目（[2014]842）

王儲炎（1982-），男，講師，博士，主要從事食品加工的教學科研工作。