響應(yīng)面法優(yōu)化油棗中總黃酮的提取工藝

王爭爭，楊慶文，楊宇霞，張 磊，趙 欣，李 慧

（1.山西省生物研究所，山西太原030006；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西太谷030801）

響應(yīng)面法優(yōu)化油棗中總黃酮的提取工藝

王爭爭1，2，楊慶文1，楊宇霞1，張 磊1，趙 欣1，李 慧1

（1.山西省生物研究所，山西太原030006；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西太谷030801）

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對影響油棗中總黃酮提取的3個(gè)主要因素，乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度進(jìn)行研究，利用Design Expert軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到預(yù)測模型，并進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，該方法的最佳提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，料液比1∶50（g∶mL），提取溫度83℃，在此條件下油棗中總黃酮含量為6.70 mg/g。

油棗；總黃酮；提取工藝；響應(yīng)面法

紅棗（Zizyphu jujube Dates），又名中華大棗、棗、華棗，是鼠李科棗屬植物棗樹（Zizyphu jujube M ill）的果實(shí)。紅棗在數(shù)千年廣泛栽培中，經(jīng)過不斷選擇，演化出很多品種，其中油棗色深紅、油光發(fā)亮，個(gè)大、核小、肉厚、含糖高、含脂高，耐儲(chǔ)藏，營養(yǎng)價(jià)值高，豐產(chǎn)性能好[1-2]，為山西省十大名棗之一。隨著近幾年人們對紅棗功能成分和藥理的深入研究，發(fā)現(xiàn)紅棗中含有一些生物活性成分，如黃酮、多糖、三萜類化合物等[3]。其中黃酮類化合物有抗炎、抗病毒、利膽、強(qiáng)心、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛及抗氧化、清除自由基、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等諸多功效，已列為保健食品的一類功能因子[4-6]，因此對棗中的總黃酮進(jìn)行提取研究具有很好的應(yīng)用價(jià)值[7-9]。

響應(yīng)面分析（response surface methodology，RSM）是利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用多元二次回歸方程擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過分析回歸方程來求得最佳工藝參數(shù)[10]，是一種優(yōu)化反應(yīng)條件和加工工藝參數(shù)的有效方法[11]。它與正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法相比，具有試驗(yàn)周期短，得到的回歸方程精度高，可以研究多種因素間交互作用等優(yōu)點(diǎn)[11-12]。

基于上述優(yōu)點(diǎn)，本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對油棗中總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳提取工藝條件，為油棗的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油棗：產(chǎn)于山西省保德縣，烘干研磨，過60目篩，密封，置陰涼干燥處備用。

蘆丁對照品：中國藥品生物制品檢定所；無水乙醇（分析純）：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；亞硝酸鈉（分析純）、氫氧化鈉（分析純）：北京化工廠；硝酸鋁（分析純）：天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1601紫外可見分光光度計(jì)：北京瑞利分析儀器公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精密稱取干燥至質(zhì)量恒定的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，加體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇定容至25 m L，得質(zhì)量濃度為0.4 mg/m L蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2 m L、0.4 m L、0.6 m L、0.8 m L、1.0 m L于10 m L比色管中，加入5%的亞硝酸鈉0.3m L，搖勻后放置6min，加入10%的硝酸鋁溶液0.3m L，搖勻后放置10 m in，加入4%的氫氧化鈉4 m L，用體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇定容，混勻后放置10 m in，于510 nm波長處測定吸光度值，參比為空白試劑[13]。

1.3.2 油棗中總黃酮的提取及含量測定

試驗(yàn)采用乙醇回流熱提取法[12]對棗中的總黃酮進(jìn)行提取。準(zhǔn)確稱取0.5 g棗粉，定量加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，在一定溫度下浸提一定時(shí)間，離心后定容至50 m L，得待測樣品溶液。準(zhǔn)確吸取上述待測液2 m L于10 m L比色管中按照1.3.1中方法進(jìn)行比色，并用如下公式計(jì)算總黃酮含量。

式中：C為依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得被測液中總黃酮的質(zhì)量濃度，mg/m L；V1為試樣處理后總定容體積，m L；V2為測定時(shí)樣液定容體積，m L；V3為測定用樣液體積，m L；m為稱取油棗粉的質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

（1）乙醇體積分?jǐn)?shù)

準(zhǔn)確稱取0.5g棗粉6份，分別加入體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液25m L，于80℃水浴上回流提取60 min，離心后定容至50 m L，測定不同乙醇體積分?jǐn)?shù)提取的樣品中的總黃酮含量。

（2）料液比

準(zhǔn)確稱取0.5 g棗粉6份，分別加入5 m L、10 m L、15 m L、20 m L、25 m L、30 m L的體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇溶液，于80℃水浴上回流提取60 min，離心后定容至50 m L，測定不同料液比下所提取的樣品中的總黃酮含量。

（3）提取時(shí)間

準(zhǔn)確稱取0.5 g棗粉6份，加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液25 m L，于80℃水浴上分別回流提取30 m in、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min，離心后定容至50 m L，測定不同提取時(shí)間所提取的樣品中的總黃酮含量。

（4）提取溫度

準(zhǔn)確稱取0.5 g棗粉6份，加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液25 m L，分別于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃水浴上回流提取60 min，離心后定容至50 m L，測定不同溫度下提取的樣品中的總黃酮含量。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Design-Expert 8.0軟件中Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選擇影響總黃酮提取量的3個(gè)主要因素：乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、提取溫度（C），以總黃酮提取量（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.5 驗(yàn)證性試驗(yàn)

通過Design-Expert8.0軟件分析，對二次多項(xiàng)回歸方程模型得出的最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照1.3.1配制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，以蘆丁質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=12.493x-0.002 9，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7，表明二者線性關(guān)系良好。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對油棗中總黃酮提取量的影響

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取量的影響Fig.2 Effects of ethanol content on total flavonoids extraction

由圖2可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，油棗中總黃酮提取量先升高后下降，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)60%時(shí)，其總黃酮提取量達(dá)最大值6.422 mg/g，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)再增加時(shí)，其總黃酮提取量下降，可能是由于總黃酮類化合物隨著乙醇含量增加，其溶解度降低，同時(shí)一些醇溶性物質(zhì)、色素、親脂性強(qiáng)的成分溶出量增加，這些物質(zhì)同總黃酮類化合物競爭同乙醇和水分子的結(jié)合，從而導(dǎo)致總黃酮提取量的下降[15]。因此，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%為宜。

圖3 不同料液比對總黃酮提取量的影響Fig.3 Effects of sdid-liquid ratio on total flavonoids extraction

2.3 料液比對油棗中總黃酮提取量的影響由圖3可知，隨著料液比的增大，油棗中總黃酮提取量的含量先增加后緩慢降低，當(dāng)料液比為1∶50（g∶m L）時(shí)總黃酮提取量達(dá)最大值6.460 mg/g。這是因?yàn)樘崛┹^少時(shí)，黃酮溶出量不夠，而當(dāng)擴(kuò)散達(dá)到平衡時(shí)，提取劑量不會(huì)促進(jìn)黃酮的提取，反而把其他物質(zhì)溶出，在分離去除這些物質(zhì)時(shí)可能帶走了少量黃酮所致。因此，料液比1∶50（g∶m L）較為適宜。

2.4 提取時(shí)間對油棗中總黃酮提取量的影響

圖4 不同提取時(shí)間對總黃酮提取量的影響Fig.4 Effects of extraction time on total flavonoids extraction

由圖4可知，隨著提取時(shí)間的增加，總黃酮的提取量呈增加趨勢，雖然在180 min時(shí)總黃酮提取量達(dá)到最大值6.460 mg/g，但在120 m in時(shí)總黃酮的提取量就達(dá)到了6.346 mg/g，從提取工藝的時(shí)間、周期、節(jié)約能源等角度考慮，提取時(shí)間120 min較為適宜。

2.5 提取溫度對油棗中總黃酮提取量的影響

由圖5可知，隨著提取溫度的升高，總黃酮的提取量先升高后趨于平緩，在80℃時(shí)總黃酮提取量達(dá)到一個(gè)最大值6.384 mg/g，90℃時(shí)略有降低。這是由于溫度的升高加速黃酮類物質(zhì)的滲透、擴(kuò)散、溶解速度等，使之更容易被提取出來，但過高的溫度會(huì)使黃酮類化合物氧化[10]。因此，提取溫度80℃為宜。

圖5 不同提取溫度對總黃酮提取量的影響Fig.5 Effects of extraction temperature on total flavonoids extraction

2.6 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.6.1 總黃酮提取響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，固定提取時(shí)間為120min，以總黃酮提取量（Y）為響應(yīng)值，對油棗中總黃酮提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面分析，其具體試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。運(yùn)用Design-Expert 8.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiments

以油棗中總黃酮含量（Y）為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合后，各試驗(yàn)因子對響應(yīng)值的影響可用如下二元回歸方程表示：

表3 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

該模型的決定系數(shù)R2=0.966 6，表示有96.66%的數(shù)據(jù)可用該模型解釋，說明方程可靠性較高。變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）值越低說明試驗(yàn)穩(wěn)定性越好，本試驗(yàn)的CV值為2.39%，說明試驗(yàn)穩(wěn)定性好，試驗(yàn)操作可信。

由表3的方差分析結(jié)果看，模型的P值＜0.01（極顯著），表明模型充分?jǐn)M合試驗(yàn)數(shù)據(jù)，該方程是油棗中總黃酮含量與提取工藝參數(shù)的合適數(shù)學(xué)模型，能較好地起到預(yù)測作用。失擬項(xiàng)P值為0.112 9＞0.1（不顯著），表明試驗(yàn)的誤差較小，未知因素對試驗(yàn)干擾很少。P值越小說明對總黃酮含量影響越大，所以影響油棗中總黃酮含量的因素按影響大小排序依次為C（提取溫度）＞A（乙醇體積分?jǐn)?shù)）＞B（料液比）。

2.6.2 響應(yīng)面交互作用分析

通過Design-Expert 8.0軟件對各因素之間的交互作用進(jìn)行響應(yīng)面分析，繪制響應(yīng)面曲線圖和等高線圖，結(jié)果見圖6。

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和提取溫度的交互作用對總黃酮提取量的響應(yīng)曲面和等高線Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interaction between ethanol concentration,liquid-solid ratio and extraction temperature on total flavonoids content

由圖6可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比的增加，總黃酮提取量均先增加后降低，說明乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比過高或過低都不能使總黃酮提取量達(dá)最大值，只有它們?nèi)〉竭m中值時(shí)，才可能最大限度地提取油棗中的總黃酮。從等高線圖上看，幾乎呈圓形，表明乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比交互作用不明顯，且圓形封閉，說明同時(shí)存在最大值。

總黃酮含量與乙醇體積分?jǐn)?shù)呈明顯的二次拋物線關(guān)系，在60%左右出現(xiàn)峰值。根據(jù)相似相溶原理，油棗中總黃酮極性與此范圍的乙醇極性相當(dāng)，因此在這一體積分?jǐn)?shù)溶液中溶解性較好；總黃酮含量隨提取溫度增加顯著增加，但達(dá)到一定穩(wěn)定后略有下降。從等高線圖上看，呈的橢圓形，表明乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取溫度交互作用較明顯，且橢圓形封閉，說明同時(shí)存在最大值。

總黃酮含量與料液比也呈明顯的二次拋物線關(guān)系，在料液比1∶50（g∶m L）左右出現(xiàn)峰值。從等高線圖上看，呈的橢圓形，表明料液比與提取溫度交互作用較明顯，且橢圓形封閉，說明同時(shí)存在最大值。

圖6可直觀地反映各因素交互作用對總黃酮得率和總黃酮含量的影響。圖中曲線越陡峭，表明該因子對油棗中總黃酮提取量的影響越大；反之，曲線越平滑，表明該因子對油棗中總黃酮提取量的影響較小。根據(jù)以上的數(shù)據(jù)分析表明油棗中總黃酮含量的交互影響順序?yàn)椋篈C＞BC＞AB。

2.7 油棗中總黃酮提取工藝條件的優(yōu)化

經(jīng)Design-Expert8.0軟件優(yōu)化，油棗總黃酮最佳提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)64.69%，料液比1∶50.33（g∶m L），提取溫度83.46℃，此時(shí)總黃酮提取量理論值達(dá)6.681 65 mg/g。考慮到實(shí)際操作的可行性，將提取工藝條件修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，料液比1∶50（g∶m L），提取溫度83℃。為驗(yàn)證結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化出的工藝參數(shù)進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得到油棗中總黃酮的實(shí)際提取量為6.70 mg/g，與理論預(yù)測值接近，表明建立的數(shù)學(xué)模型對油棗中總黃酮的提取具有實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

響應(yīng)面分析法得到的油棗中總黃酮提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，料液比1∶50（g∶m L），提取溫度83℃。經(jīng)過驗(yàn)證試驗(yàn)后，得到油棗中總黃酮的實(shí)際提取量為6.70 mg/g，與理論預(yù)測值接近，表明響應(yīng)面法可以很好地對油棗中總黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

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Optimization of total flavonoids extraction process from Chinese jujube by response surface methodology

WANG Zhengzheng1,2,YANG Qingwen1,YANG Yuxia1,ZHANG Lei1,ZHAO Xin1,LI Hui1
(1.Shanxi Institute of Bio logy,Taiyuan 030006,China;2.College of Horticulture,Shanxi Agricultural University,Taigu 030801,China)

On the basis of single factor tests,the factors of ethanol concentration,solid-liquid ratio and extraction temperature that affect total flavonoid extraction from Chinese jujube were studied by response surface methodology and the model was forecasted and analyzed with Design Expert software.The results showed that the optimum extraction conditions were obtained as follows:ethanol content 65%,solid-liquid ratio 1∶50(g∶m l), extraction temperature 83℃.Under this condition,the content of total flavonoids was 6.70 mg/g in Chinese jujube.

Chinese jujube;total flavonoids;extraction technology;response surface methodology

TS255.3

A

0254-5071（2015）03-0090-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.021

2015-02-06

山西科技攻關(guān)項(xiàng)目（20110311012-6）

王爭爭（1982-），女，助理研究員，博士研究生，研究方向?yàn)槭称芳庸づc安全。