利用葡萄渣黑曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)果膠酶的研究

曹珂珂，李 妍

（蚌埠學(xué)院生物與食品工程系，安徽蚌埠233030）

利用葡萄渣黑曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)果膠酶的研究

曹珂珂，李 妍

（蚌埠學(xué)院生物與食品工程系，安徽蚌埠233030）

對黑曲霉（Aspergillus niger）BB-6利用葡萄渣固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)果膠酶的發(fā)酵條件進(jìn)行研究。結(jié)果表明，在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加葡萄糖4%、硫酸銨0.6%，含水量60%，培養(yǎng)溫度30℃條件下培養(yǎng)72 h，果膠酶酶活達(dá)12.226 U/g。

果膠酶；葡萄渣；黑曲霉；固態(tài)發(fā)酵

Key worlds:pectinase;grape pomace;Aspergillus niger;solid state fermentation

果膠酶（pectinase）是分解果膠物質(zhì)的多種酶的總稱，主要包括原果膠酶（protopectinase，PPase）、多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）、果膠裂解酶（pectate lyases，PL）和果膠酯酶（pectin esterase，PE）[1-3]。果膠酶是世界上四大酶制劑之一，主要應(yīng)用于果汁澄清、果蔬汁提取、果實(shí)脫皮、木材防腐、麻類脫膠、棉織物精煉加工等行業(yè)[4-6]。果膠酶來源于植物和微生物，目前商品果膠酶主要來源于微生物所產(chǎn)的果膠酶。細(xì)菌、放線菌、霉菌和酵母菌都能產(chǎn)生果膠酶[7-9]，黑曲霉（Aspergillus niger）是公認(rèn)的安全級(jí)微生物，其代謝產(chǎn)物果膠酶也是安全的。

葡萄渣是釀酒過程中的下腳料，包括葡萄籽和葡萄皮，其含有粗蛋白、粗纖維、粗脂肪、多種微量元素和果膠等[10-11]。葡萄渣一般都是直接作為飼料，其所產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)價(jià)值相對較低，通過固態(tài)發(fā)酵能提升葡萄渣的潛在價(jià)值。目前利用葡萄渣固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)果膠酶的研究還比較少，因此本實(shí)驗(yàn)采用黑曲霉（Aspergillus niger）BB-6作為產(chǎn)酶菌株，利用葡萄渣和麩皮固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)果膠酶，為提高葡萄渣的產(chǎn)品附加值開辟新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑曲霉（A.niger）BB-6由蚌埠學(xué)院生物與食品工程系微生物實(shí)驗(yàn)室保存；葡萄渣為鮮葡萄榨汁后，果渣烘干、粉碎、過篩。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯浸汁（20%）100 m L，葡萄糖2 g，瓊脂1.5～2 g，pH自然。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮10 g，水60%，pH自然。

半乳糖醛酸（分析純）：上海酶聯(lián)生物科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）試劑、葡萄糖、硫酸銨等均為分析純：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；果膠：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

752N紫外可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；BHC生物潔凈安全柜：蘇州凈化設(shè)備有限公司；LRH微電腦控制生化培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠；KDC高速冷凍離心機(jī)：科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；BSD立式智能精密搖床：上海恒訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 果膠酶活力檢測

采用3,5-二硝基水楊酸法（DNS法）[12]。酶活定義：在50℃、pH 5.0的條件下，1 h分解果膠產(chǎn)生1 mg半乳糖醛酸為一個(gè)酶活力單位（U/g）。

1.3.2 葡萄渣與麩皮的添加比例

在初始發(fā)酵培養(yǎng)基中添加葡萄渣，使葡萄渣與麩皮分別按不同質(zhì)量比0∶10、3∶7、5∶5、7∶3、10∶0混合均勻。滅菌后接入1 m L孢子懸液（含黑曲霉孢子107CFU/m L），30℃培養(yǎng)72 h，每隔24 h扣瓶一次，確定葡萄渣與麩皮的最佳比例。固態(tài)發(fā)酵結(jié)束后，在三角瓶中加入料液比1∶10（g∶m L）的含0.01%吐溫-80的蒸餾水，在30℃條件下浸提50 min。抽濾，4 000 r/m in離心15 m in，上清即為粗酶液，測定果膠酶酶活。

1.3.3 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化的單因素試驗(yàn)

（1）有機(jī)碳源：在固態(tài)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入葡萄糖2%、4%、6%、8%、10%，考察葡萄糖的添加量對果膠酶酶活的影響。

（2）無機(jī)氮源：在固態(tài)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入硫酸銨0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，考察硫酸銨的添加量對酶活的影響。

（3）培養(yǎng)溫度：將固態(tài)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基分別在20℃、25℃、28℃、30℃、35℃培養(yǎng)72 h，考察溫度對酶活的影響。

（4）培養(yǎng)時(shí)間：將固態(tài)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基在一定溫度下將黑曲霉（Aspergillus niger）BB-6分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h、120 h，考察培養(yǎng)時(shí)間對酶活的影響。

（5）含水量：將固態(tài)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基含水量分別調(diào)為30%、40%、50%、60%、70%，考察含水量對酶活的影響。

1.3.4 培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取碳源、無機(jī)氮源、培養(yǎng)溫度和含水量4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄渣與麩皮的添加比例

表1 葡萄渣和麩皮的不同配比對產(chǎn)酶的影響Table 1 Effect of different ratio of grape promace and wheat bran on pectinase production

相對于初始發(fā)酵培養(yǎng)基（10 g麩皮），添加葡萄渣有利于果膠酶的產(chǎn)生，因?yàn)槠咸言泻泄z物質(zhì)，而果膠酶屬于誘導(dǎo)酶，葡萄渣既是誘導(dǎo)物又可以作為碳源，所以添加葡萄渣能提高果膠酶的產(chǎn)量。葡萄渣和麩皮的比例合適，不僅對產(chǎn)酶有利，而且還能減少原料的浪費(fèi)。由表1可知，當(dāng)葡萄渣與麩皮以5∶5質(zhì)量比混合時(shí)酶活最大7.122 U/g。麩皮含有多種營養(yǎng)物質(zhì)，可以提供碳源、氮源，而且有一定的疏松度，能給黑曲霉的生長提供充足的氧氣。葡萄渣作為誘導(dǎo)物添加到培養(yǎng)基中，隨著葡萄渣含量的增加，果膠酶活力逐漸增提高，若繼續(xù)增加其含量，則酶活隨之下降，可能是葡萄渣含量過高，吸水后容易結(jié)塊，影響氧的傳遞進(jìn)而影響黑曲霉生長。因此，葡萄渣與麩皮以質(zhì)量比5∶5作為固態(tài)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為宜。

2.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 有機(jī)碳源對產(chǎn)酶的影響

圖1 葡萄糖添加量對酶活的影響Fig.1 Effect of glucose addition on pectinase activity

由圖1可知，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加有機(jī)碳源葡萄糖對酶活力有一定的影響，酶活力隨著葡萄糖添加量的增加先升高后降低。一定含量的葡萄糖能提高果膠酶的產(chǎn)量，

而過多的葡萄糖則抑制了酶的產(chǎn)生。當(dāng)葡萄糖的含量為4%時(shí)，酶活力達(dá)到最大8.496 U/g。

2.2.2 無機(jī)氮源對產(chǎn)酶的影響

圖2 硫酸銨添加量對酶活的影響Fig.2 Effect of ammonium sulfate addition on pectinase activity

硫酸銨是速效無機(jī)氮源，在發(fā)酵初期首先被利用，價(jià)格低廉，適合于工業(yè)生產(chǎn)。在固態(tài)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加硫酸銨對酶活有一定的影響。由圖2可知，隨著硫酸銨添加量的增加，酶活先升高后降低，當(dāng)硫酸銨的添加量為0.4%時(shí)，酶活力最大為8.709 U/g。

2.2.3 培養(yǎng)溫度對酶活的影響

將固態(tài)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基分別放入20～35℃培養(yǎng)72 h，考察培養(yǎng)溫度對酶活的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，培養(yǎng)溫度對酶活力的有一定的影響，適宜的溫度有利于菌體的生長和果膠酶的產(chǎn)生，其最佳產(chǎn)酶溫度為28℃，發(fā)酵時(shí)可以控制培養(yǎng)溫度在28～30℃。

圖3 培養(yǎng)溫度對酶活的影響Fig.3 Effect of culture temperature on pectinase activity

2.2.4 含水量對酶活的影響

水是機(jī)體的重要組成部分，培養(yǎng)基的含水量影響菌體細(xì)胞的生長繁殖，同時(shí)也是產(chǎn)酶的重要影響因素之一。在固態(tài)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入30%～70%的水，考察含水量對酶活的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 含水量對酶活的影響Fig.4 Effect of water content on pectinase activity

由圖4可知，培養(yǎng)基含水量為30%～50%，果膠酶酶活力隨著含水量增加而增高；培養(yǎng)基含水量＞50%后，果膠酶酶活力隨著含水量增加而降低；其含水量為50%時(shí)，果膠酶活力最大8.343 U/g。培養(yǎng)基含水量低，無法滿足菌體生長所需的水分，產(chǎn)酶較少；培養(yǎng)基含水量過高，培養(yǎng)基容易結(jié)塊，影響氧的傳遞，黑曲霉只能在培養(yǎng)基的表面生長，發(fā)酵不均勻而影響產(chǎn)酶。因此，培養(yǎng)基含水量50%為宜。

2.2.5 培養(yǎng)時(shí)間對酶活的影響

培養(yǎng)時(shí)間對產(chǎn)酶非常重要，如果培養(yǎng)時(shí)間短，菌體處于生長期，產(chǎn)酶量很少；如果培養(yǎng)時(shí)間過長，培養(yǎng)基消耗過多，營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不上，產(chǎn)酶減少，同時(shí)菌體在生長代謝中還會(huì)產(chǎn)生很多副產(chǎn)物，影響產(chǎn)酶及后期酶的純化。由圖5可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，酶活逐漸增強(qiáng)，72 h時(shí)酶活達(dá)到最大7.961 U/g，此后繼續(xù)培養(yǎng)，果膠酶活力雖有所下降，但降幅相對較小。因此，培養(yǎng)時(shí)間為72 h為宜。

圖5 培養(yǎng)時(shí)間對酶活的影響Fig.5 Effect of culture time on pectinase activity

2.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因子試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定培養(yǎng)時(shí)間為72 h，以果膠酶活力作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)對菌株產(chǎn)酶條件（葡萄糖添加量、硫酸銨添加量、培養(yǎng)溫度、含水量）進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3。

表2 培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for culture conditions optimization

由表2可知，4種因素對產(chǎn)酶的影響大小依次為葡萄糖添加量＞含水量＞硫酸銨添加量＞培養(yǎng)溫度，最佳培養(yǎng)基組合是A2B3C4D3，即葡萄糖添加量4%，硫酸銨添加量0.6%，培養(yǎng)溫度30℃、含水量60%。在此最佳條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測得果膠酶活力為12.226 U/g。由表3可知，葡萄糖的添加量對果膠酶活性有顯著的影響，其他因素對果膠酶活性影響均不顯著。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal tests results

3 結(jié)論

葡萄渣作為釀酒行業(yè)的副產(chǎn)物，大多被作為飼料或肥料，甚至作為垃圾直接扔掉，不僅附加值低，還可能會(huì)造成環(huán)境污染[13-15]。為了擴(kuò)大葡萄渣的應(yīng)用范圍，本研究采用黑曲霉BB-6作為產(chǎn)酶菌株，利用葡萄渣固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)果膠酶，對其產(chǎn)酶培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，在麩皮5 g、葡萄渣5 g的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加4%葡萄糖和0.6%硫酸銨，含水量60%，30℃恒溫培養(yǎng)72 h，果膠酶酶活達(dá)12.226 U/g，說明利用葡萄渣固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)果膠酶是可行的，通過此方法能提高葡萄渣的應(yīng)用價(jià)值。

[1]林樹花，李高陽，譚歡，等.果膠酶高產(chǎn)菌選育研究進(jìn)展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工·創(chuàng)新版，2009，194（12）：53-57.

[2]陳瑋琳，張惠玲，周曉娟.一株低產(chǎn)甲醇的果膠酶菌種選育及產(chǎn)酶工藝優(yōu)化[J].中國釀造，2013，32（10）：66-73.

[3]王媛.果膠酶高產(chǎn)菌株篩選發(fā)酵條件優(yōu)化以及酶學(xué)性質(zhì)的研究[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2010.

[4]張浩森.黑曲霉高產(chǎn)菌株的篩選及其酶學(xué)性質(zhì)的研究[D].無錫：江南大學(xué)碩士論文，2008.

[5]徐沖，關(guān)艷麗，馮敏.產(chǎn)果膠酶菌株的篩選[J].微生物學(xué)雜志，2013，33（5）：66-68.

[6]李瑜.腐爛蘋果中產(chǎn)果膠酶菌株的分離及產(chǎn)酶條件的優(yōu)化[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)碩士論文，2009.

[7]李祖明，張洪勛，白志輝，等.微生物果膠酶研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào)，2010（3）：42-46.

[8]ZHOU J M,GE X Y,ZHANG W G.Improvement of polygalacturonase production at high temperature by mixed culture of Aspergillus niger and Saccharomyces cerevisiae[J].Bioresource Technol,2011,102(8):10085-10088.

[9]袁志輝.一株果膠酶產(chǎn)生菌的篩選、鑒定及其產(chǎn)酶條件研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2013，25（12）：1627-1630，1637.

[10]DíAZ A B,DE ORY I,CARO I,et al.Enhance hydrolytic enzymes production by Aspergillus awamori on supplemented grape pomace[J].Food Bioprod Process,2012,90(1):72-78.

[11]馮昕煒，許貴善.發(fā)酵葡萄渣營養(yǎng)成分分析[J].塔里木大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，23（2）：97-99.

[12]張飛，岳田利，費(fèi)堅(jiān)，等.果膠酶活力的測定方法研究[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2004，13（4）：134-137.

[13]張秀玲，祝義偉，孫佳平.釀酒后的葡萄渣的綜合利用[J].食品工業(yè)科技，2008，29（7）：284-286.

[14]WILKINS M R,WIDMER W W,GROHMANN K,et al.Hydrolysis of grapefruit peel waster with cellulase and pectinase enzymes[J].Bioresource Technol,2007,98(8):1596-1601.

[15]馮昕煒，許貴善，劉昱成.酵母菌發(fā)酵葡萄渣發(fā)酵效果研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（2）：222-223.

《中國釀造》雜志廣告征訂啟事

《中國釀造》創(chuàng)刊于1982年，是由中國商業(yè)聯(lián)合會(huì)主管，中國調(diào)味品協(xié)會(huì)及北京食品科學(xué)研究院主辦的綜合性科技月刊（國內(nèi)統(tǒng)一刊號(hào)CN 11-1818/TS，國際標(biāo)準(zhǔn)刊號(hào)ISSN 0254-5071，廣告許可證號(hào)：京宣工商廣字第0033號(hào)）。全國各地郵局均可訂閱，郵發(fā)代號(hào)：2-124；國外總發(fā)行：中國國際圖書貿(mào)易總公司，國外發(fā)行代號(hào)：BM 1437?！吨袊勗臁窔v次被評(píng)為全國中文核心期刊、中國科技核心期刊、《中國知網(wǎng)》重點(diǎn)收錄期刊、《萬方數(shù)據(jù)庫》全文收錄期刊、《中文科技期刊數(shù)據(jù)庫》來源期刊、中國學(xué)術(shù)期刊網(wǎng)絡(luò)出版總庫收錄期刊、美國《烏利希期刊指南》收錄期刊、英國《食品科學(xué)文摘》（FSTA）收錄期刊、英國《國際農(nóng)業(yè)與生物科學(xué)研究中心》（CABI）收錄期刊、美國《化學(xué)文摘》收錄期刊，中國科學(xué)評(píng)價(jià)研究中心（RCCSE）數(shù)據(jù)庫收錄期刊，中國科學(xué)引文數(shù)據(jù)庫（CSCD）遴選數(shù)據(jù)庫收錄期刊，也是學(xué)位與研究生教育的中文重要期刊。

《中國釀造》重點(diǎn)報(bào)道調(diào)味品、釀酒、食品微生物、食品添加劑、發(fā)酵乳制品、生物工程技術(shù)、生物化工、生物質(zhì)能源的開發(fā)利用等研究方向的新工藝、新技術(shù)、新設(shè)備、分析檢測、安全法律法規(guī)及標(biāo)準(zhǔn)、保鮮與貯運(yùn)技術(shù)、綜合利用、質(zhì)量保障體系等方面的基礎(chǔ)理論、應(yīng)用研究及綜述文章。設(shè)有“研究報(bào)告”、“專論綜述”、“創(chuàng)新借鑒”、“經(jīng)驗(yàn)交流”、“分析檢測”、“產(chǎn)品開發(fā)”、“釀造文化”、“海外文摘”等欄目。

《中國釀造》發(fā)行歷史長、范圍廣、行業(yè)知名度高，廣告影響面大，效果甚佳，而且價(jià)格合理，是一個(gè)理想的宣傳媒體。歡迎新老廣告客戶來函、來電、來人聯(lián)系辦理廣告業(yè)務(wù)，我們將提供一切方便，竭誠為您服務(wù)。

《中國釀造》是您企業(yè)品牌推廣、品質(zhì)提升、技術(shù)交流、產(chǎn)品推介的最佳平臺(tái)。

郵箱：zgnzzz@163.com網(wǎng)站：www.chinabrewing.net.cn電話：010-83152738/83152308

《中國釀造》雜志社

Pectinase production by Aspergillus niger solid state fermentation with grape pomace

CAO Keke,LI Yan
(Department of Biology and Food Engineering,Bengbu University,Bengbu 233030,China)

The fermentation conditions of Aspergillus niger BB-6 by solid-state fermentation with grape pomace for pectinase production were studied.The results showed that the optimal culture condition for the basic fermentation culture medium was glucose 4%,ammonium sulfate 0.6%, water content 60%.Under the condition of 30℃,the activity of pectinase could reach 12.226 U/g at 72 h.

Q939.97

A

0254-5071（2015）03-0083-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.019

2015-01-19

蚌埠學(xué)院自然科學(xué)研究項(xiàng)目（2011ZR16）；蚌埠學(xué)院優(yōu)秀中青年骨干教師培養(yǎng)計(jì)劃

曹珂珂（1980-），女，講師，碩士，研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵。