發(fā)酵飼料用微生物的分離與鑒定

于寒松，辛迎雪，張杰，李倬林，李鐵柱*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春130118；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，吉林長春130124）

發(fā)酵飼料用微生物的分離與鑒定

于寒松1，辛迎雪1，張杰2，李倬林2，李鐵柱2*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春130118；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，吉林長春130124）

從24份納豆粉、鮮納豆和豆豉中篩選出16株納豆芽孢桿菌，從20份酒曲中篩選出14株釀酒酵母，從20份腌制酸菜中篩選出14株植物乳桿菌，并對(duì)其菌落特征、菌體形態(tài)觀察和生理生化特性三方面進(jìn)行對(duì)比研究和系統(tǒng)鑒定，旨在為開發(fā)具有復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料的生產(chǎn)與應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

納豆芽孢桿菌；釀酒酵母；植物乳桿菌；分離；鑒定

相對(duì)于普通飼料，發(fā)酵飼料具有顯著的優(yōu)勢，它一方面可以提高和改善飼料原料的營養(yǎng)價(jià)值消除飼料原料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，另一方面可以提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能，減少動(dòng)物疾病的發(fā)病率[1]。我國目前經(jīng)批準(zhǔn)的飼用微生物主要有乳酸菌[2-5]、芽孢桿菌[6]、酵母菌[7]、放線菌、光合細(xì)菌[8]五大類，作為益生菌的納豆芽孢桿菌、酵母菌、植物乳桿菌因其特有的生物特性成為研究熱點(diǎn)[9]。因此，本研究對(duì)不同來源的納豆粉、鮮納豆、豆豉、酒曲及酸菜中的納豆芽孢桿菌、酵母菌、植物乳桿菌進(jìn)行了篩選及鑒定研究，目的是獲得性能優(yōu)良可用于發(fā)酵飼料的生產(chǎn)菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

納豆芽孢桿菌試驗(yàn)材料：24份來自江西、上海、臺(tái)灣等地的納豆菌粉、鮮納豆、干黑豆豉樣品。

植物乳桿菌試驗(yàn)材料：20份來自吉林、白城、延吉等地手工腌制東北酸菜樣品。

酵母菌試驗(yàn)材料：20份來自貴州、蘇州、浙江、湖北、四川等地的酒曲樣品。

1.1.2 培養(yǎng)基[10-11]

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，MRS培養(yǎng)基，麥芽汁培養(yǎng)基，基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA），玉米粉培養(yǎng)基，麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基，脫脂牛奶培養(yǎng)基，V-P培養(yǎng)基，淀粉水解培養(yǎng)基，明膠液化培養(yǎng)基，糖類發(fā)酵培養(yǎng)基，醇類發(fā)酵培養(yǎng)基，尿素培養(yǎng)基，硝酸鹽還原培養(yǎng)基，乳鏈球菌（Streptococcus lactis，SL）培養(yǎng)基，HP培養(yǎng)基，多價(jià)蛋白胨-酵母膏培養(yǎng)基（poly peptone yeast extract，PY），醋酸鉛培養(yǎng)基，蛋白胨水培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

BCN-1360B超凈工作臺(tái)：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；MLS-3780高壓蒸汽滅菌鍋：日本Sanyo公司；BX51光學(xué)顯微鏡：日本OLYMPUS公司；HZQ-Q電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；VITEK 2 COMPACT全自動(dòng)細(xì)菌及藥敏分析系統(tǒng)：法國生物梅里埃公司；705超低溫冰柜：美國ThermoElectron公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 分離與純化

（1）納豆芽孢桿菌的分離與純化

在無菌條件下稱取16種納豆菌粉各0.1 g置于裝有10 m L無菌生理鹽水的試管，取4種鮮納豆、4種干黑豆豉各1g置于裝有100m L無菌生理鹽水的三角瓶中，振蕩器上充分振蕩30 min，80℃水浴10 m in后，迅速冷卻至室溫，將此菌懸液作為原始菌液[11]。

將制備好的24份樣品菌懸液，充分搖勻后用無菌生理鹽水梯度稀釋到10-7，各取100 μL上述10-1～10-7稀釋度的菌懸液于含鹽量2%的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板，每處理設(shè)3個(gè)平行，涂勻稀釋液。

將上述平板移至37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長情況挑取具有芽孢桿菌細(xì)胞形態(tài)的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察對(duì)得到的單菌落多次劃線分離純化，直至獲得純種菌。

納豆芽孢桿菌的復(fù)篩主要是利用納豆枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的特性，用無菌牙簽沾取少許培養(yǎng)24 h的待測菌株，點(diǎn)種于脫脂牛奶培養(yǎng)基上，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)18 h，選取菌落周圍產(chǎn)生水解圈的菌株作為最終分離得到的菌株[12-16]。

（2）植物乳桿菌的分離與純化

在無菌條件下稱取20份酸菜各20 g切碎，分別移至180 m L無菌蛋白胨中，振蕩混勻，靜置數(shù)分鐘，取上層清液備用。

按接種量10%將酸菜發(fā)酵液接入MRS液體培養(yǎng)基，30℃厭氧培養(yǎng)48 h，連續(xù)增殖2～3次，增殖后的樣品用無菌生理鹽水梯度稀釋至10-7，用傾注平板法取10-5、10-6、10-7稀釋度的稀釋液在含鈣MRS培養(yǎng)基平板上涂勻，再覆蓋一層2%瓊脂培養(yǎng)基制成厭氧環(huán)境，30℃倒置培養(yǎng)48 h，選取單菌落多次劃線分離純化直至獲得純種菌。

（3）酵母菌的分離與純化

在無菌條件下稱取20份酒曲各1 g置于裝有100 m L無菌水的三角瓶中振蕩搖勻制成菌懸液，將此菌懸液作為原始菌液。

將制備好的20份樣品菌懸液，用無菌水梯度稀釋到10-6，用傾注平板法取100 μL上述10-2～10-6稀釋度的菌懸液于PDA瓊脂培養(yǎng)基和麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基平板，每處理設(shè)3個(gè)平行，涂勻稀釋液。

將上述平板移至28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h，觀察菌落形態(tài)選定疑似酵母菌落反復(fù)進(jìn)行劃線分離純化，確認(rèn)后挑取單菌落到PDA斜面培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)48 h后置于4℃保存?zhèn)溆肹17-18]。

1.3.2 鑒定

（1）納豆芽孢桿菌的鑒定

進(jìn)行形態(tài)觀察，將菌株劃線涂布于活化培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落如顏色、形狀、透明度、邊緣、隆起形狀等。進(jìn)行革蘭氏染色和芽孢染色，在油鏡下觀察菌體形狀和芽孢著生情況，菌體大小用顯微測微尺進(jìn)行測量。

根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[19]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》，對(duì)分離得到的菌株進(jìn)行生理生化鑒定試驗(yàn)；而纖溶活性測定是用試驗(yàn)所分離的菌株制作納豆，將制成的納豆用蒸餾水充分洗滌后離心上清液，在纖維蛋白平板[20]加上清液10 μL，放置37℃培養(yǎng)15 h，觀察溶解圈的形成情況從而確定菌種。

（2）植物乳桿菌的鑒定

菌種初步鑒定是采用乳酸紙層析實(shí)驗(yàn)，展開劑是水∶苯甲醇∶正丁醇=1∶5∶5，另加1%的甲酸，顯色劑為0.04%溴甲酚藍(lán)酒精溶液，2%分析純?nèi)樗岷涂瞻着囵B(yǎng)液作對(duì)照。

根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》將經(jīng)過乳酸紙層析實(shí)驗(yàn)篩選出的菌株分別進(jìn)行分離培養(yǎng)基平板上菌落形態(tài)特征的觀察、革蘭氏染色后顯微鏡下菌株形態(tài)觀察、各種生理生化特征試驗(yàn)的觀察。

（3）酵母菌的鑒定

將待測菌用稀釋平板法在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基和PDA瓊脂培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)36 h，選取單個(gè)菌落觀察其顏色、形狀、透明度、光滑、濕潤和邊緣整齊等特征；細(xì)胞形態(tài)的觀察是用呂氏美蘭染液染色顯微鏡下觀察；假菌絲形態(tài)是將待測菌接種于玉米瓊脂平板28℃培養(yǎng)72 h進(jìn)行觀察；子囊孢子的觀察是將待測菌接種于麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基斜面上，28℃培養(yǎng)7 d后用孔雀綠芽孢染液染色顯微鏡下觀察[20]。

根據(jù)《酵母菌特征及鑒定手冊》和《真菌鑒定手冊》[21]，對(duì)分離出的菌株進(jìn)行生理生化試驗(yàn)，分析菌種的生理生化性質(zhì)，應(yīng)用全自動(dòng)細(xì)菌及藥敏分析系統(tǒng)及rDNA的18S序列進(jìn)行菌株鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離與純化

納豆芽孢桿菌的分離與純化：在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上經(jīng)過多次劃線分離后，從納豆菌粉、鮮納豆、干黑豆豉中共分離24株菌。

植物乳桿菌的分離與純化：在MRS固體培養(yǎng)基平板上經(jīng)過多次劃線分離后，從酸菜中共分離20株菌。

酵母菌的分離與純化：在PDA瓊脂培養(yǎng)基和麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基平板上經(jīng)過多次劃線分離后，從酒曲中共分離20株菌。

2.2 菌的鑒定

2.2.1 納豆芽孢桿菌的鑒定

（1）納豆芽孢桿菌菌落形態(tài)和顯微形態(tài)觀察

分離得到16株菌株N1-N16，經(jīng)菌落形態(tài)觀察，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上菌落呈灰白色，近圓形，表面干燥粗糙，不透明，無光澤，中間凸起有皺褶，邊緣不光滑成裂葉狀，中央顏色深于邊緣部分，用牙簽挑取菌落有拉絲現(xiàn)象，在平板上菌落成樹狀生長，結(jié)果見圖1。

顯微鏡下對(duì)培養(yǎng)24 h的菌株進(jìn)行個(gè)體形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)菌株為革蘭氏染色呈陽性，鏡下細(xì)胞形態(tài)為桿狀，菌株的細(xì)胞排列多以單個(gè)、成對(duì)、長絲狀或成鏈排列，兩面鈍圓，產(chǎn)芽孢，芽孢呈橢圓或柱狀，中生或近中生且不膨大，根據(jù)以上特征可初步將此菌株歸為芽孢桿菌屬，結(jié)果見圖2。

圖1 納豆芽孢桿菌的菌落形態(tài)Fig.1 Colonial morphology of Bacillus natto

圖2 納豆芽孢桿菌的細(xì)胞形態(tài)Fig.2 Cells morphology of Bacillus natto

（2）菌株生理生化特性

根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》中芽孢桿菌屬的鑒別特征，以枯草芽孢桿菌作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照菌株，共同進(jìn)行生理生化特性試驗(yàn)。鑒定結(jié)果（表1）表明N1等16株菌株與對(duì)照菌株生理生化特性相同，均為芽孢桿菌屬，因此依據(jù)各鑒定試驗(yàn)的結(jié)果可初步判定16株菌株均屬于納豆菌為枯草芽孢桿菌亞種。

表1 菌株N1-N16鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of strain N1-N16

2.2.2 植物乳桿菌的鑒定

（1）植物乳桿菌菌落形態(tài)和顯微形態(tài)觀察

分離得到14株菌株Z1-Z14，經(jīng)菌落形態(tài)觀察，在MRS瓊脂培養(yǎng)基平板上菌落呈白色，圓形，中央凸起，表面光滑，邊緣整齊，質(zhì)地均勻，而且在挑取菌體時(shí)都有一定的黏性，結(jié)果見圖3。

顯微鏡下對(duì)培養(yǎng)24 h的菌株進(jìn)行個(gè)體形態(tài)觀察從中挑選出透明圈明顯，有明顯乳酸菌菌落形態(tài)的觀察發(fā)現(xiàn)菌株革蘭氏染色呈陽性，鏡下細(xì)胞形態(tài)為桿狀，排列方式有單個(gè)、成對(duì)或鏈狀排列，不產(chǎn)芽孢，結(jié)果見圖4。

圖3 植物乳桿菌的菌落形態(tài)Fig.3 Colonial morphology of Lactobacillus plantarum

圖4 植物乳桿菌的細(xì)胞形態(tài)Fig.4 Cells morphology of Lactobacillus plantarum

（2）菌株生理生化特性

根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》和《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[22]中乳酸菌的鑒別特征，并結(jié)合生理生化特性的試驗(yàn)。植物乳桿菌及Z1-Z14生理生化特性見表2。由表2可知，Z1等14株菌株的生理生化鑒定結(jié)果與植物乳桿菌相同，表明其均屬于植物乳桿菌。

表2 菌株Z1-Z14菌株鑒定結(jié)果Tab le 2 Identification results of strain Z1-Z14

2.2.3 酵母菌的鑒定

（1）酵母菌菌落形態(tài)和顯微形態(tài)觀察

分離得到的14株菌株J1-J14，經(jīng)菌落形態(tài)觀察，在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基平板和PDA培養(yǎng)基平板上菌落呈乳白色，圓形，表面濕潤光滑，不透明，黏稠，有光澤，中間凸起明顯，邊緣整齊，易挑起，打開平板后可聞到較強(qiáng)的發(fā)酵香氣，結(jié)果見圖5。

顯微鏡下對(duì)培養(yǎng)48 h的菌株進(jìn)行個(gè)體形態(tài)觀察，鏡下細(xì)胞形態(tài)為球形或卵圓形，大小均勻，無性生殖有各種出芽生殖方式，包括單端出芽，兩端出芽和三邊出芽，該菌株無樹狀假菌絲，產(chǎn)子囊孢子，不產(chǎn)擲孢子，根據(jù)以上特征可初步將此菌株歸為酵母菌屬，結(jié)果見圖6。

圖5 釀酒酵母的菌落形態(tài)Fig.5 The colonial morphology of Saccharomyces cerevisiae

圖6 釀酒酵母的細(xì)胞形態(tài)Fig.6 Cells morphology of Saccharomyces cerevisiae

（2）菌株生理生化特性

表3 菌株J1-J14鑒定結(jié)果Table 3 Identification results of strain J1-J14

根據(jù)《酵母菌特征及鑒定手冊》和《真菌鑒定手冊》中酵母菌的鑒別特征，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征并進(jìn)行常規(guī)的生理生化特性試驗(yàn)，J1等14株菌株的生理生化鑒定見表3。依據(jù)表3結(jié)果可初步判定為酵母菌，應(yīng)用全自動(dòng)細(xì)菌及藥敏分析系統(tǒng)鑒定，與標(biāo)準(zhǔn)釀酒酵母菌株符合率達(dá)93%，為使鑒定更精確還通過rDNA的18S序列進(jìn)行鑒定符合率達(dá)99%，從而確定菌種為釀酒酵母。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用微生物分離純化技術(shù)從不同納豆、酒曲、酸菜樣品中各分離24株菌、20株菌、20株菌。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)和分子生物學(xué)鑒定初步確定出16株納豆芽孢桿菌，14株植物乳桿菌，14株釀酒酵母。

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Isolation and identification of microorganism for fermented feed

YU Hansong1,XIN Yingxue1,ZHANG Jie2,LI Zhuolin2,LI Tiezhu2*
(1.College of Food Science and Engineering,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China; 2.Institue of Agro-Food Technology,Jilin Academy of Agricultural Sciences,Changchun 130124,China)

16 strains of Bacillus natto were screened from 24 kinds of natto powder,fresh natto and fermented soybean,14 strains of Saccharomyces cerevisiae were screened from 20 species of distiller's yeast,and 14 strains of Lactobacillus plantarum were screened from 20 kinds of pickled Chinese cabbage.The colony characteristics,bacteria morphology and physiological-biochemical characteristic were observed and identified.The experiment was in order to provide experimental basis to the production and application of composite probiotic fermented feed.

Bacillus natto;Saccharomyces cerevisiae;Lactobacillus plantarum;screening;identification

Q93-331

A

0254-5071（2015）03-0058-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.013

2015-01-21

吉林省重大科技攻關(guān)專項(xiàng)（20140203014NY）；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（31101245）；吉林省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（20150101087JC）資助；吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20140204051YY）資助

于寒松（1979-），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。

*通訊作者：李鐵柱（1978-），男，副研究員，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸铩?/p>