5株酵母菌的系統(tǒng)發(fā)育樹分析以及發(fā)酵性能測定

蔣 麗，董 丹，邢亞閣，車振明*，羅建峰

（1.西華大學生物工程學院食品生物技術(shù)重點實驗室，四川成都610039；2.理縣塔斯酒莊有限公司，四川阿壩藏族羌族自治州623100）

5株酵母菌的系統(tǒng)發(fā)育樹分析以及發(fā)酵性能測定

蔣 麗1，董 丹1，邢亞閣1，車振明1*，羅建峰2

（1.西華大學生物工程學院食品生物技術(shù)重點實驗室，四川成都610039；2.理縣塔斯酒莊有限公司，四川阿壩藏族羌族自治州623100）

從四川藏區(qū)高原威代爾冰葡萄渣泥中分離純化出5株酵母，用18S rDNAD1/D2區(qū)域序列，通過序列比對及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析，通過WL培養(yǎng)基的培養(yǎng)觀察和普通光學顯微鏡觀察，并且進一步對5種酵母菌的發(fā)酵性能進行測定。結(jié)果表明：JH、JH1、JH2、JH3和JH4分別鑒定為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、解脂耶羅維亞酵母（Yarrowia lipolytica）和異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。該5種酵母菌均有一定的發(fā)酵能力，并且發(fā)酵液總酚、還原糖、果糖以及總酸含量等均有不同變化?？傮w來說，JH2的發(fā)酵性能最好。

酵母菌；分離鑒定；發(fā)酵性能；系統(tǒng)發(fā)育樹

酵母菌是葡萄酒釀造的主要微生物，酵母菌是發(fā)酵過程的主導，不同的酵母可以賦予葡萄酒不同給感官風味[1]。近年來人們開始重視眾多天然酵母在原產(chǎn)地葡萄酒生產(chǎn)中的重要貢獻，積極開發(fā)原生態(tài)天然菌群的耦合，實現(xiàn)多菌株組合發(fā)酵，充分凸現(xiàn)天然酵母的優(yōu)良特性，釀造味感豐富、香氣濃郁、風格獨具的產(chǎn)地葡萄酒[2]。釀酒酵母屬的發(fā)酵特性因菌株的不同而存在明顯差異，菌株的不同導致利用的底物不同、生成的化學物質(zhì)不同，從而使發(fā)酵產(chǎn)物的風味物質(zhì)存在差異，賦予產(chǎn)品獨特的風味[3]。川西高原藏區(qū)阿壩州理縣以其特殊的氣候條件，開發(fā)研制了威代爾等系列冰葡萄酒，不僅酒體口感好，味道獨特，而且很受當?shù)厝说南矚g[4]。在冰葡萄酒生產(chǎn)中，由于影響葡萄酒品質(zhì)的關(guān)鍵因素是其中的發(fā)酵微生物，而酵母菌作為主要的發(fā)酵微生物不僅對葡萄酒產(chǎn)量、質(zhì)量和發(fā)酵生產(chǎn)管理影響很大，而且對葡萄酒特色和風格的形成也至關(guān)重要。所以為了找出更適合釀造冰葡萄酒的酵母菌，要求了解掌握酵母菌的一系列發(fā)酵性能。

隨著應用于酵母菌分類的快速鑒定系統(tǒng)不斷面市，Biolog系統(tǒng)以其數(shù)據(jù)庫大、鑒定范圍廣，鑒定快速等優(yōu)點，目前已經(jīng)成為國際上酵母菌多相分類鑒定常用的技術(shù)手段[5-6]。已有文獻表明，Biolog系統(tǒng)對于釀酒酵母的鑒定具有好的效果，鑒定結(jié)果可達100%，在KUTTZMANC P等[7]提及到的所定的同種內(nèi)不同菌株間的差異不超過1%的標準。利用基因測序通過對威代爾葡萄汁發(fā)酵過程中的酵母菌JH、JH1、JH2、JH3和JH4菌種進行了系統(tǒng)發(fā)育樹分析，并進一步研究了5株菌株的發(fā)酵性能，為川西藏區(qū)冰葡萄酒擴大生產(chǎn)及品質(zhì)控制提供了一定的技術(shù)支持，對川西高原冰葡萄酒行業(yè)的發(fā)展具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

龍泉巨峰葡萄：西華大學紅光鎮(zhèn)。

1.1.1 菌種來源

從四川藏區(qū)高原威代爾冰葡萄渣泥中分離出5株酵母菌，分別編號為JH、JH1、JH2、JH3和JH4。

1.1.2 試劑

氫氧化鈉、基準鄰苯二甲酸氫鉀、葡萄糖、果糖等其他試劑均為分析純：成都科龍化工廠。

1.1.3 培養(yǎng)基

WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：酵母浸粉0.5%，胰蛋白胨0.5%，葡萄糖5%，瓊脂2%。磷酸二氫鉀0.055%，氯化鉀0.042 5%，氯化鈣0.012 5%，氯化鐵0.000 25%，硫酸鎂0.012 5%，硫酸錳0.000 25%，溴甲酚綠0.002 2%，將上述成分配好后加熱溶解，pH 6.5，121℃滅菌20 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：酵母浸粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，瓊脂2%，pH自然，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

高壓滅菌鍋DHP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海益恒實驗儀器公司；721分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；SHB-B型恒溫振蕩箱：金壇市富華儀器有限公司；pHS-25精密pH計：上海精科雷磁儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌的形態(tài)學觀察

菌落形態(tài)特征：將篩選菌株接種與YPD液體培養(yǎng)基和WL固體平板上，29℃培養(yǎng)3 d，分別觀察固體菌落和液體菌落形態(tài)特征，液體菌落形態(tài)觀察以不加菌液為參比對象。

細胞形態(tài)特征：用接種環(huán)挑取少許WL平板上培養(yǎng)48 h的菌株，滴加1滴1%美蘭染色液染色后，在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)特征。

1.3.2 酵母菌的發(fā)酵性能實驗

采用新鮮成熟的龍泉巨峰葡萄，運至實驗室后破碎，調(diào)節(jié)pH值為3.6，二氧化硫含量為60 mg/kg，將5株酵母菌活化后，按0.6%的接種量分別接種與裝有500 m L新鮮葡萄漿發(fā)酵罐中，15℃恒溫發(fā)酵。測定指標有總酸、還原糖、果糖、總酚含量，同時以不添加任何酵母菌的葡萄汁作為對照實驗。

1.3.3 總酚含量的測定[8]

正常發(fā)酵生產(chǎn)的葡萄酒中富含多酚類化合物。試樣中的多酚化合物在堿性條件下，與福林酚試劑形成藍色物質(zhì)，在波長765 nm處測定吸光度值，可通過測定其吸光度值計算總酚的含量。

1.3.4 還原糖含量的測定

采用國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中直接滴定法。

1.3.5 總酸含量的測定

采用國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中電位滴定法，利用酸堿中和原理，用氫氧化鈉標準溶液直接滴定樣品中的有機酸，以pH=8.2為電位滴定終點，根據(jù)消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積，計算試樣中的總酸含量。

1.3.6 果糖含量的測定

采用分光光度法測定發(fā)酵液中果糖的含量[9]。

1.3.7 ITS序列擴增、測序以及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

對分離出的5株酵母菌進行總脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的提取、基因間隔序列（internal transcript space，ITS）序列擴增以及測序[10-12]，然后用核酸序列數(shù)據(jù)庫GenBank中進行同源序列搜索，用Blast軟件進行同源性比較，采用MEGA5.2軟件進行ITS同源性分析，繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

對于酵母菌株JH、JH1、JH2、JH3和JH4分別下載酵母屬13、11、15、17和15個相關(guān)菌種模式株的18S rDNA D1/D2區(qū)序列采用同樣方法進行序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹分析。

采用18S rDNA序列分析法對分離出的菌株進行分子鑒定。采用玻璃珠法[14]提取基因組總DNA：聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）體系為30 μL重蒸水，5 μL 10×PCR擴增緩沖液（Mg2+Free），6 μL MgCl2（25 mmol/L），4μL三磷酸脫氧核苷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（2.5mmol/L），正向引物NS1（5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′）和反向引物NS8（5′-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3′）各1 μL，1 μL Tap聚合酶（2.5 U/μL），2 μL總DNA模板。

PCR反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸2 min，經(jīng)30個循環(huán)后最終72℃保持10 m in，然后等溫度降至4℃停止運行。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的形態(tài)學觀察

2.1.1 菌落形態(tài)特征

各菌株在WL培養(yǎng)基上涂布培養(yǎng)3 d后，JH、JH1、JH2、JH3和JH4菌株的單菌落形態(tài)特征結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，單菌落的形態(tài)特征各不相同。JH菌落呈深綠色，平坦，表面光滑，不透明，奶油狀，邊緣光滑。JH1菌落呈棕色，平坦，表面光滑，不透明，奶油狀，邊緣光滑。JH2菌落呈奶油色帶淡綠色，球形突起，表面光滑，不透明，奶油狀，邊緣光滑。JH3菌落呈淡藍色，球形突起，表面光滑，不透明，奶油狀，邊緣光滑。JH4菌落呈乳白色，球形突起，表面光滑，不透明，奶油狀，邊緣光滑。

圖1 JH、JH1、JH2、JH3和JH4菌株固體培養(yǎng)菌落特征Fig.1 Colonial characteristics of cultured JH,JH1,JH2,JH3 and JH4 on solid agar medium

2.1.2 細胞形態(tài)特征

JH、JH1、JH2、JH3和JH4菌株的細胞形態(tài)特征見圖2。

圖2 JH、JH1、JH2、JH3和JH4菌株單體出芽生殖形態(tài)Fig.2 Morphology of individual spores germ ination o f JH,JH1, JH2,JH3 and JH4

由圖2可知，5種酵母菌細胞都呈卵圓形或球形，菌株的生長方式為出芽生殖。

2.2 PCR擴增目的基因的結(jié)果

標準品基因和目的基因擴增電泳結(jié)果見圖3。由圖3電泳結(jié)果可知，對樣本的18S rDNA基因進行PCR擴增，所擴增片段的大小約為1.8 kb，和真核生物的18S rRNA/DNA基因片段大小一致，因此達到了對酵母的18S rDNA基因的PCR擴增目的。通過基因測序，采用BLAST和ClustalX程序與GenBank中以收錄的酵母18S rDNA D1/D2區(qū)序列比對，鑒定出JH、JH1、JH2、JH3、JH4五種菌株分別為有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、解脂耶羅維亞酵母（Yarrowia lipolytica）和異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。

圖3 目的基因擴增電泳圖(瓊脂糖1%)Fig.3 PCR amplification electrophoretogram of target gene (agarose 1%)

2.3 實驗菌株JH的序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

ITS區(qū)域核酸序列的相似性已經(jīng)成為確定酵母菌分類地位的重要分子生物學依據(jù)[14]，根據(jù)菌株JH、JH1、JH2、JH3、JH4的ITS測序結(jié)果進行Blast分析，以18S rDNA序列同源性為基礎(chǔ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖4。

圖4 菌株JH(a)、JH1(b)、JH2(c)、JH3(d)和JH4(e)18S rDNA D1/D2基因序列NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Neighbor-joining phylogenetic tree constructed from 18S rDNA gene D1/D2 sequence of JH(a),JH1(b), JH2(c),JH3(d)and JH4(e)

由圖4可知，菌株JH、JH1、JH2、JH3、JH4與GenBank中其他一些參考酵母菌株的親緣關(guān)系。其中菌株JH與葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）有較高相似性，相似度達99%以上，與其親緣關(guān)系最近，故鑒定菌株菌株JH為萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）。其中菌株JH1與美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）有較高相似性，相似度達99%以上，與其親緣關(guān)系最近，故鑒定菌株菌株JH1為美極梅奇酵母（Metschikowia pulcherrima）。菌株JH2與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）有較高相似性，相似度100%，與其親緣關(guān)系最近，故鑒定菌株菌株JH2為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。菌株JH3與解脂耶羅維亞酵母（Yarrowia lipolytica）有較高相似性，相似度100%，與其親緣關(guān)系最近，故鑒定菌株菌株JH3為解脂耶羅維亞酵母（Yarrawia lipolytica）。其中菌株JH4與異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）有較高相似性，相似度100%，與其親緣關(guān)系最近，故鑒定菌株菌株JH4為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。

圖5 葡萄酒發(fā)酵期間總酚含量的變化Fig.5 Change of total phenols content during wine fermentation

2.4 總酚含量測定結(jié)果

由圖5可知，這五種發(fā)酵液中的總酚含量都隨著發(fā)酵時間的延長呈下降趨勢，速度較快，這有可能是因為發(fā)酵過程中酵母釋放次級代謝產(chǎn)物如丙酮酸、乙醛等到發(fā)酵液中，與多酚類的物質(zhì)發(fā)生反應生成一些大分子衍生物；此外，微生物產(chǎn)生的酶也會使其發(fā)生降解，導致水溶性不斷下降而沉淀下來[15]。添加JH1酵母的發(fā)酵液中的總酚含量下降得最快，從最初含量462.86 mg/L下降至112.86 mg/L，然而對于未添加酵母的發(fā)酵液中總酚含量變化趨勢是先快后慢，尤其是在前6 d，從496.79 mg/L下降至327.14 mg/L，在后期，總酚含量下降趨于平緩，是所有發(fā)酵液中減慢速度最緩慢。結(jié)果表明，在發(fā)酵后期，發(fā)酵液中總酚含量比較：添加JH1酵母的發(fā)酵液＜添加JH3酵母的發(fā)酵液＜添加JH4酵母的發(fā)酵液＜添加JH酵母的發(fā)酵液＜添加JH2酵母的發(fā)酵液＜未添加任何酵母的發(fā)酵液。

2.5 果糖含量測定結(jié)果

圖6 葡萄酒發(fā)酵期間果糖含量的變化Fig.6 Change of fructose content during wine fermentation

由圖6可知，在發(fā)酵葡萄汁初期，果糖最的含量達到1 751 μg/L，6種發(fā)酵液的果糖含量隨著發(fā)酵天數(shù)的增加逐漸減少，在發(fā)酵初期（0～6 d），果糖含量減慢的速度最快，在6～17 d內(nèi)，6種發(fā)酵液果糖含量下降緩慢，在發(fā)酵后期（17～23 d），其果糖含量基本保持平穩(wěn)，變化不大。從酵母菌發(fā)酵性能的差異性來分析，在發(fā)酵6d內(nèi)，添加JH和JH2酵母菌的發(fā)酵液在發(fā)酵中期果糖量最大，說明對果糖的利用率比較高，JH和JH2的果糖含量分別從1 685 μg/L下降至528.2 μg/L、416.11 μg/L，都比不添加酵母菌的發(fā)酵液減慢得快；但添加JH1酵母菌的發(fā)酵液消耗果糖量都比未添加酵母菌的發(fā)酵液小。從6 d到發(fā)酵結(jié)束，未添加JH酵母的發(fā)酵液消耗的果糖量比其他5種方式消耗的果糖量多，然而，添加酵母菌JH1、JH2、JH3和JH4酵母菌的發(fā)酵液中消耗果糖含量比未添加酵母菌消耗的果糖量少，這是可能添加的酵母菌有可能會抑制其他酵母菌的生長，使果糖的利用率降低。但在發(fā)酵后期，所有發(fā)酵液中的果糖含量降低速率基本一致即趨于平緩，這可能因為在發(fā)酵后期酒精含量增加，抑制酵母菌的生長；或是在發(fā)酵后期酵母菌數(shù)量減少也會使糖的利用率降低。

圖7 葡萄酒發(fā)酵期間總酸含量的變化Fig.7 Change of total acid content during wine fermentation

2.6 總酸含量測定結(jié)果

葡萄酒中的酸類物質(zhì)可以平衡酒體。適量的酸含量能在口感上平衡酒體里的酒精和甜度，讓葡萄酒甜而不膩，增強葡萄鮮果的水果風味，增加味覺的舒適性[16]不同葡萄汁發(fā)酵過程中，不同酵母菌在相同溫度下總酸含量變化如圖7所示。由圖7可知，在0～6 d內(nèi)，添加JH、JH1、JH3和JH4菌的發(fā)酵液中的總酸含量在降低，而JH2和為添加酵母菌的發(fā)酵液總酸含量在0～5 d降低；隨著時間的增加，6種發(fā)酵液的總酸含量都平緩增加。根據(jù)池成[17]報道醋酸菌會導致葡萄酒中醋酸等揮發(fā)酸含量顯著升高，使葡萄酒產(chǎn)生特殊的令人不愉快的酸苦味，所以在葡萄酒釀造中合理控制發(fā)酵過程中總酸的產(chǎn)生是釀造葡萄酒的重要工藝流程之一。當發(fā)酵到最后各發(fā)酵液中總酸含量的比較：JH1＞JH2＞JH＞JH4＞原液＞JH3，說明JH菌產(chǎn)生的總酸最多，其次是JH2、JH、JH4和未添加酵母菌，產(chǎn)生總酸最少是添加JH3菌的酵母菌。

2.7 還原糖含量測定結(jié)果

圖8 葡萄酒發(fā)酵期間還原糖含量的變化Fig.8 Change of reducing sugar content during wine fermentation

由圖8可知，6種發(fā)酵液的糖度隨著發(fā)酵天數(shù)的增加逐漸減少，在發(fā)酵初期（0～9 d），還原糖減慢的速度較緩慢，在9～12 d內(nèi)，6種發(fā)酵液還原糖含量急劇下降，在發(fā)酵后期，其還原糖含量平穩(wěn)下降，變化不大。從酵母菌發(fā)酵性能的差異性來分析，添加JH和JH3酵母菌的發(fā)酵液在發(fā)酵中期消耗糖量最大，JH和JH3的還原糖含量分別從120.87 g/L、115.29 g/L變成47.56 g/L、42.22 g/L，都比不添加酵母菌的發(fā)酵液減慢得快；但添加JH1、JH2和JH4酵母菌的發(fā)酵液在發(fā)酵中期消耗糖量都比未添加酵母菌的發(fā)酵液小；尤其是添加JH1酵母菌的發(fā)酵液還原糖降低的含量最小。這是可能添加的酵母菌有可能會抑制其他酵母菌的生長，使糖的利用率降低。在發(fā)酵后期，所有發(fā)酵液中的還原糖含量降低速率基本一致即趨于平緩。這是可能因為在發(fā)酵后期酒精含量增加，會抑制酵母菌的生長；或是在發(fā)酵后期酵母菌數(shù)量減少也會使糖的利用率降低。

3 結(jié)論

本研究從四川藏區(qū)高原威代爾冰葡萄果實中分離純化并鑒定出的菌株。系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果表明，該菌株與GenBank中相關(guān)標準菌株的18S rDNA D1/D2區(qū)序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹顯示，這五種菌株分別與Hanseniaspora uvarum、Metschnikowia pulcherrima、Saccharomyces cerevisiae、Yarrowia lipolytica和Wickerhamomyces anomalus處在同一分枝。根據(jù)酵母菌株同一個種的不同菌株18S rDNA D1/D2區(qū)核酸替換率不超過1%，因此將該五種菌株分別鑒定為葡萄汁有孢漢遜酵母、美極梅奇酵母、釀酒酵母、解脂耶羅維亞酵母和異常威克漢姆酵母。

通過對這五種酵母菌發(fā)酵性能實驗分析，該5種酵母菌均有一定的發(fā)酵能力，發(fā)酵液中總酚含量、還原糖含量、果糖含量以及總酸含量隨著發(fā)酵時間的延長而改變，并且添加葡萄汁有孢漢遜酵母的發(fā)酵液消耗的果糖多，消耗果糖最少的是添加解脂耶羅維亞酵母的發(fā)酵液；發(fā)酵液中總酸含量變化最大的是添加美極梅奇酵母，變化最小的是添加解脂耶羅維亞酵母；發(fā)酵液中添加解脂耶羅維亞酵母消耗的還原糖最多；添加JH1酵母的發(fā)酵液中的總酚含量下降最慢，不添加酵母的發(fā)酵液總酚含量下降最快。總體來說，菌株JH2發(fā)酵性能最好。

此研究對篩選川西冰葡萄酒產(chǎn)區(qū)特色酵母菌，并構(gòu)建出冰葡萄酒發(fā)酵微生物資源庫具有一定意義，并且為川西藏區(qū)冰葡萄酒標準化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

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《中國釀造》雜志征稿啟事

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《中國釀造》主要欄目有：研究報告、專論綜述、創(chuàng)新與借鑒、經(jīng)驗交流、分析與檢測、產(chǎn)品開發(fā)、釀造文化、海外文摘等。

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征稿范圍：

（1）新工藝、新技術(shù)、新設(shè)備在釀造行業(yè)的應用；（2）調(diào)味品的研發(fā)創(chuàng)新與推廣應用；（3）調(diào)味品產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)管理及產(chǎn)品質(zhì)量安全評價；（4）食品添加劑在釀造行業(yè)的應用；（5）現(xiàn)代高新檢測技術(shù)在釀造行業(yè)的應用；（6）釀酒產(chǎn)品開發(fā)、生產(chǎn)管理及產(chǎn)品質(zhì)量安全的控制；（7）發(fā)酵法制備酒精、氨基酸、高級醇及有機酸等工藝研究；（8）微生物發(fā)酵工藝及培養(yǎng)基發(fā)酵條件優(yōu)化；（9）發(fā)酵工程菌種的篩育與人工誘變、雜交選育及基因工程改造研究；（10）生物質(zhì)能源的開發(fā)利用及規(guī)模化制備；（11）傳統(tǒng)發(fā)酵食品生產(chǎn)工藝改進、微生物菌種改良、發(fā)酵機理及規(guī)?；a(chǎn)研究；（12）食品及發(fā)酵工業(yè)廢水、廢渣處理及綜合利用；（13）益生菌及功能型發(fā)酵乳制品研究與開發(fā)；（14）行業(yè)實用技術(shù)、政策、法規(guī)、標準及行業(yè)動態(tài)和最新舉措等。

注意事項：

（1）來稿要求論點明確、數(shù)據(jù)可靠、邏輯嚴密、文字精煉。在文稿首頁用腳注說明論文屬何項目、何基金（編號）資助，本刊將優(yōu)先報道國家級、省部級及國際合作項目的科研成果；第一作者及通訊作者（一般為導師）簡介（包括姓名、出生年月、性別、職稱、學位、研究方向或目前主要從事的工作、郵箱、聯(lián)系電話）。（2）稿件要求8000字以內(nèi)，須有中圖分類號，文獻標志碼，中英文標題、單位、作者，并有200～300字的中英文摘要和5～8個關(guān)鍵詞，標題、摘要、表題、圖題請用中英文對照。摘要內(nèi)容應包括研究目的、方法、結(jié)果和結(jié)論；綜述文章可寫指示性摘要。（3）來稿內(nèi)容涉及配方時，應寫明配料的名稱和配比，勿用代號；工藝過程要完整，不要省略；插圖、表格需放在正文相應地方，不要集中；引用的圖表要有出處，計量要用法定單位。（4）文稿參考文獻一般研究論文約25篇參考文獻，不可少于20篇，綜述論文不少于35篇。研究性論文和綜述性論文中近5年文獻不少于參考文獻總數(shù)的一半，外文文獻不少于5篇，期格式請參照GT/T 7714—2005《文后參考文獻著錄規(guī)則》。（5）來稿必須是最新的、作者自身創(chuàng)造性的科研成果，且是在中外文正式刊物上未發(fā)表的論文。本刊嚴禁一稿多投、重復內(nèi)容多次投稿、不同文種重復投稿。（6）我刊以實現(xiàn)對所有來稿的文字復制比對工作，若文字復制比超過30%的稿件我刊不予采用。（7）稿件一經(jīng)錄用，即被認為同意收錄于《中國學術(shù)期刊（光盤版）》、萬方數(shù)據(jù)庫等，同意入編數(shù)據(jù)庫及上網(wǎng)發(fā)布，與此有關(guān)的作者著作權(quán)使用費與稿酬一次性給付。作者如有異議，請在投稿時聲明。

Phylogenetic analysis and fermentation properties of five yeast strains

JIANG Li1,DONG Dan1,X ING Yage1,CHE Zhenming1*,LUO Jianfeng2
(1.Key Laboratory of Food Biotechnology,College of Bioengineering,Xihua University,Chengdu 610039,China; 2.Lixian Tasijiuzhuang Co.,Ltd.,Ngawa Prefecture 623100,China)

Five strains of yeast were isolated from the Sichuan Tibetan Plateau Vidal Ice grape slag mud and identified using 18S rDNAD1/D2,after sequences analysis and phylogenetic tree construction and analysis.The yeasts were cultured by WL medium and observed by ordinary optical microscope,and further fermenting property of five strains of yeast were determined.Results showed that JH,JH1,JH2,JH3 and JH4 were identified as Hanseniaspora uvarum,Metschnikowia pulcherrima,Saccharomyces cerevisia,Yarrowia lipolytica,Wickerhamomyces anomalus,respectively.The five kinds of yeasts had certain fermenting property.The changes of total phenol,reducing sugar,fructose and total acidin fermentation broth were different.In conclusion,JH2 had the optimal fermenting property.

yeasts;isolation and identification;fermenting property;phylogenetic analysis

TS261.1

A

0254-5071（2015）03-0048-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.011

2015-01-19

省科技支撐計劃項目（2011SZ0284，2012SZ0117，13KCBZ0066）；2012年西華大學食品生物技術(shù)重點實驗室開放研究基金資助項目（SZjj2012-005）；2013年西華大學研究生創(chuàng)新基金項目（ycjj201346）

蔣麗（1989-），女，碩士研究生，研究方向為食品科學。

*通訊作者：車振明（1960-），男，教授，本科，研究方向為食品發(fā)酵技術(shù)。