自制胱抑素C免疫診斷試劑的性能評價

張玉靜

（上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司 上海 200444）

自制胱抑素C免疫診斷試劑的性能評價

張玉靜*

（上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司 上海 200444）

目的：評價自主研發(fā)的胱抑素（Cyc）C免疫診斷試劑（終點法）在自動化檢測血清中Cyc C濃度的性能。方法：采用奧林巴斯AU680全自動生化分析儀，經(jīng)重復(fù)性、線性試驗后，測定血清中Cyc C濃度，進(jìn)行方法學(xué)評價及與美國Diazyme Cyc C試劑（終點法）比較。結(jié)果：試劑在兩個水平質(zhì)控下測定的變異系數(shù)（CV）分別為2.62%和1.79%，在0～8 mg/L濃度范圍內(nèi)，線性良好。兩種試劑測定血清Cyc C濃度的相關(guān)系數(shù)較好，相關(guān)系數(shù)r=0.995。結(jié)論：自主研發(fā)的Cyc C試劑盒操作簡便、快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，安全性及有效性符合臨床應(yīng)用要求，可以滿足大批量臨床樣本的常規(guī)和自動化分析，是一種值得推廣的診斷試劑。

胱抑素C 膠乳增強(qiáng)免疫比濁法 診斷試劑 性能評價

胱抑素C（Cys C）是一種低分子量蛋白質(zhì)，可由機(jī)體所有有核細(xì)胞產(chǎn)生，產(chǎn)生率恒定。循環(huán)中的Cyc C僅經(jīng)腎小球濾過而被清除，是一種反映腎小球濾過率變化的理想內(nèi)源性標(biāo)志物[1]，而腎小球的濾過率(glomerular filtration rate，GFR)是監(jiān)測腎功能的一個重要指標(biāo)，尤其對于腎移植的病人，快速準(zhǔn)確地掌握腎小球濾過率的變化是十分重要的。此外由于Cyc C分子量大于肌酐，且?guī)д姾?，所以它更容易反映腎小球濾過膜通透性的早期變化[2-4]，可以在腎小球濾過率輕微降低時升高，較肌酐更敏感，作為腎功能試驗優(yōu)于血清肌酐，由此可見Cyc C是一種理想的反映GFR變化的內(nèi)源性標(biāo)志物，具有重要的臨床應(yīng)用價值[5-7]。

血清中Cyc C濃度較低，故其測定方法需較高的分析靈敏度及特異性。最早采用單向免疫擴(kuò)散法（RID）及酶免疫測定法（EIA）對Cyc C含量進(jìn)行測定，但它們不僅費時，且檢測限也較差；較簡單且更靈敏的放射、熒光及各種酶免疫測定（RIA、FIA及EIA）的方法雖能改善Cyc C測定的可靠性，但測定時間仍較長，無法常規(guī)應(yīng)用，更無法用于臨床急診測定。以上各種測定方法均屬非均相測定方法，很難自動化，因此限制了Cyc C含量測定在臨床的廣泛應(yīng)用。報道的膠乳免疫均相測定方法，即在膠乳顆粒上包被抗體，與抗原結(jié)合時顆粒發(fā)生凝集，很容易用于自動化測定[8-9]。本研究使用膠乳增強(qiáng)免疫方法及自制試劑測定Cyc C濃度，試劑均相穩(wěn)定，在普通實驗室的生化儀上即可短時間內(nèi)得到檢測結(jié)果，且具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點，在臨床應(yīng)用中實現(xiàn)了簡單、快速、可靠檢測，具有很高的臨床應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 儀器

日本Olympus AU680全自動生化分析儀。

1.2 試劑、校準(zhǔn)品和質(zhì)控品

復(fù)星長征自主研發(fā)Cyc C試劑（簡稱復(fù)星長征試劑）為液體雙試劑（R1和R2），R1主要成分為磷酸鹽緩沖液；R2主要成分為偶聯(lián)Cys C抗體的膠乳微球懸濁液；對照試劑、校準(zhǔn)品、配套質(zhì)控品1和配套質(zhì)控品2均購自美國Diazyme公司。

1.3 樣本

本研究的臨床血清樣本均從上海市某醫(yī)院收集，靜脈采血，樣本新鮮無溶血、無黃疸。

1.4 測定方法及條件

按照以下參數(shù)來設(shè)置奧林巴斯AU680全自動生化分析儀：

速率法：溫度37 ℃，主波長540 nm，副波長800 nm，吸光度范圍0～2 A，比色杯光徑1.0 cm，反應(yīng)方向為吸光度上升的反應(yīng)，樣本用量5 μl，復(fù)星長征試劑和Diazyme試劑均為液體雙試劑，分別由試劑1（R1）和試劑2（R2）組成。R1用量250 μl，孵育時間5 min；R2用量50 μl，平衡時間30 s，測定時間270 s，分析類型為2點終點法，校準(zhǔn)模式為非線性6點定標(biāo)。試劑線性范圍：0～8 mg/L。

1.5 空白吸光度

用試劑（盒）測試純水，記錄試劑（盒）參數(shù)規(guī)定讀數(shù)點540 nm下的吸光度值（A），重復(fù)三次。

1.6 重復(fù)性

在重復(fù)條件下，測試2個濃度分別為0.85和2.42 mg/L的質(zhì)控品，將這兩水平質(zhì)控品分別測試10次，計算測量值的平均值（x—）、標(biāo)準(zhǔn)差（s）和變異系數(shù)（CV）。

1.7 線性試驗

用接近線性范圍下限的低值樣品與接近線性范圍上限的高值樣品混合配制成0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/L的6個樣品（xi），分別用測試試劑（盒）對各樣品進(jìn)行測試，每個樣品測試3次，分別求出每個濃度樣品檢測結(jié)果的均值（yi）。以6個濃度（xi）為自變量，以檢測結(jié)果均值（yi）為因變量作線性回歸。

1.8 復(fù)星長征試劑與Diazyme試劑的對比試驗

隨機(jī)選擇67份樣本，分別用復(fù)星長征試劑與Diazyme試劑對每份樣本進(jìn)行測定，取均值，按NCCLS EP9文件的評價方案統(tǒng)計結(jié)果[10]。

2 結(jié)果

2.1 空白吸光度

三次試劑空白的檢測結(jié)果分別為0.506 7，0.507 8，0.510 4，試劑的空白變化差異的檢測結(jié)果分別為0.001 6，0.000 5，0.002 1，表明試劑空白小于0.6，試劑的空白變化率小于0.005，檢測結(jié)果符合復(fù)星長征公司的產(chǎn)品注冊標(biāo)準(zhǔn)，試劑性能可控。

2.2 重復(fù)性

低、高兩個水平質(zhì)控品濃度的平均值分別為0.83 mg/L和2.41 mg/L，變異系數(shù)（CV）分別為2.62%和1.79%，均小于5%。試劑的重復(fù)性檢測結(jié)果符合Cyc C的產(chǎn)品注冊標(biāo)準(zhǔn)，試劑性能可控。

2.3 線性試驗理論值(x)與測定值(Y)之間的線性回歸

線性試驗所得數(shù)據(jù)的線性回歸方程為Y=0.994 6X-0.016，R=0.999 7，說明試劑在Cyc C濃度0.25～8.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 復(fù)星長征試劑與Diazyme試劑的比對以及偏倚評估

復(fù)星長征試劑和Diazyme公司試劑對67例血清中Cyc C濃度測定的均值比較無顯著差異（t=0.21，P＞0.05），所測Cyc C濃度具有良好的相關(guān)性（r=0.995，圖1）。根據(jù)圖1數(shù)據(jù)對比兩方法測得的相對偏差的偏置情況，表明兩種試劑檢測同一樣本的相對偏差結(jié)果良好，少數(shù)樣本的相對偏差絕對值超過5%，但都集中在4 mg/L以上，可能是由于樣本濃度較高、個體樣本對不同試劑中抗體親和性的微小差異、試劑以及儀器的系統(tǒng)偏差所致；另一方面，正常人的Cyc C濃度參考值僅為0.5～1.0 mg/L，而高于4 mg/L樣本的相對偏差也在10%以內(nèi)。對比后顯示兩種試劑測定單個樣本偏差較小，分布較合理。

圖1 兩試劑測定血清樣本中Cyc C濃度

3 討論

國內(nèi)外大量的研究結(jié)果表明，Cys C是評估腎功能的一種敏感性好、特異性高的指標(biāo)。此外，近年來有研究結(jié)果顯示，糖尿病腎損害是糖尿病嚴(yán)重的慢性微血管并發(fā)癥，有超過30%的患者發(fā)展為腎功能衰竭及需要腎透析，杜國有，梁逸敏等[11-12]認(rèn)為，與其他指標(biāo)相比，Cys C檢出糖尿病腎病的靈敏度較高，有必要在診斷為糖尿病而無腎病癥狀的患者中定期檢測Cys C濃度變化，以便觀察其與糖尿病微血管病的關(guān)系。所以Cys C不但是急性腎病早期的標(biāo)志物，同時也與慢性腎臟疾病明顯相關(guān)。

目前，Cys C的測定方法主要有免疫印跡法。酶聯(lián)免疫法及化學(xué)發(fā)光法等，免疫印跡法操作復(fù)雜，精密度低；酶聯(lián)免疫法受人為因素影響大、自動化程度不高；而化學(xué)發(fā)光法靈敏度雖高，但檢測線性范圍較小且成本高，需要特定儀器。然而，本研究所使用的膠乳增強(qiáng)免疫法克服了上述方法中絕大多數(shù)的不足之處，具有方法簡便、快速、靈敏等優(yōu)點，對儀器設(shè)備要求不高，可以在全自動生化儀上應(yīng)用。

復(fù)星長征試劑可檢測血清樣本的Cys C濃度，與Diazyeme公司試劑所測值具有良好的線性相關(guān)性，其操作簡單、線性范圍寬、重復(fù)性好、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確，完全可以替代美國Diazyme公司的Cyc C試劑應(yīng)用于血清樣本中Cyc C濃度的自動化測定，可滿足醫(yī)院對不同人群的Cys C濃度的檢測需求。

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Evaluation of the performance of an independently developed Cys C immune diagnosis reagent

ZHANG Yujing*

(Shanghai Fosun Long March Medical Science Co. Ltd., Shanghai 200444, China)

Objective:To evaluate the performance of an independently developed immune diagnosis reagent in the conventional and automatic determination of Cys C concentration in the clinical serum.Methods:The concentrations of Cys C were determined with Olympus AU680 automatic biochemical analyzer after testing the blank absorbance, repeatability and linearity. The evaluation of the reagent was carried out and the determination results were compared with those of the control reagent (Diazyme).Results:The coefficients of variation (CV) of Cys C concentrations at two levels of quality control were 2.62% and 1.79%. The results of determination showed a good linearity over the range of 0.25～8.0 mg/L. There was a good correlation between two reagents (r=0.995).Conclusion:The Cys C reagent made by our company can provide a simple, quick, accurate and stable method for the determination of Cys C concentrations in the clinical serum and meet the requirement of the conventional and automated analysis of mass clinical samples. This method may be worthy of promotion.

Cys C; latex-enhanced immunoturbidimetry; diagnosis reagent; performance evaluation

R981.2; R446.112

B

1006-1533(2015)21-0077-03

2015-07-08）

張玉靜（1977-），女，工程師，注冊經(jīng)理，從事體外診斷試劑、生化試劑的研發(fā)與注冊。E-mail: zhangyujing@fosunpharma.com