固相萃取-液相色譜測(cè)定葡萄干中防腐殺菌劑

史龍梅，李歡，周建科

（河北大學(xué)理化分析中心，河北省分析科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定071002）

固相萃取-液相色譜測(cè)定葡萄干中防腐殺菌劑

史龍梅，李歡，周建科*

（河北大學(xué)理化分析中心，河北省分析科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定071002）

以無(wú)水硫酸鈉為分散劑，固相分散萃取葡萄干中噻苯咪唑、三唑醇、滅菌丹、咪酰胺4種防腐殺菌劑，C18固相萃取小柱凈化處理，高效液相色譜法測(cè)定。反相C18色譜柱分離，乙腈-甲醇-水（50∶10∶40，體積比）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)225 nm。在0.01μg/mL～200μg/mL范圍內(nèi)4組分線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)大于0.999 3，方法檢出限為2.0 ng/g～20.0ng/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)小于3.18%，方法適合于葡萄干中相關(guān)防腐殺菌劑的檢測(cè)。

固相萃??；高效液相色譜；噻苯咪唑；三唑醇；滅菌丹；咪酰胺

防腐殺菌劑是用于作物生長(zhǎng)后期病害防治或采收后防腐保鮮的一類農(nóng)藥，噻苯咪唑、三唑醇、滅菌丹、咪酰胺較為常用，特別是葡萄生長(zhǎng)過(guò)程中病害的防治[1]，其中咪酰胺本身屬低毒農(nóng)藥，但其最終代謝產(chǎn)物2，4，6–三氯酚，被眾多國(guó)家定為環(huán)境中優(yōu)先控制污染物[2]。水果蔬菜中防腐殺菌劑殘留的危害已引起人們的高度關(guān)注，其毒性和殘留對(duì)人體健康產(chǎn)生不利影響，甚至出現(xiàn)致癌、致畸、致突變的情況[3-4]，因此，研究葡萄干中多種防腐殺菌農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法具有重要意義。

文獻(xiàn)報(bào)道防腐殺菌劑殘留的檢測(cè)方法，主要有高效液相色譜、氣相色譜、氣質(zhì)聯(lián)用、液質(zhì)聯(lián)用、分光光度法和免疫分析法等[5-8]。目前關(guān)于防腐殺菌劑測(cè)定的樣品前處理方法主要有基質(zhì)固相分散、固相萃取、液液分散微萃取等[9-11]，對(duì)于痕量組分分析，樣品的預(yù)處理至關(guān)重要。

固相分散萃?。⊿PDE）是在基質(zhì)固相分散萃取（MSPDE）基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，與后者相比，不用裝柱，操作簡(jiǎn)單。周建科等[12]，采用該方法處理花生醬樣品，測(cè)定了苯甲酸和山梨酸2種食品防腐劑。本實(shí)驗(yàn)采用該方法提取葡萄干中4種防腐殺菌劑，C18固相萃取小柱進(jìn)一步凈化，建立了固相分散萃取C18小柱凈化、反相高效液相色譜同時(shí)測(cè)定葡萄干中噻苯咪唑、三唑醇、滅菌丹、咪酰胺4種防腐殺菌劑的分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

島津LC-10AT液相色譜儀：7725i型手動(dòng)進(jìn)樣閥，SPD-10A紫外檢測(cè)器，N-2000型雙通道色譜工作站（浙江大學(xué)智能信息工程研究所）；SZ-93自動(dòng)雙重純凈水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）；Varian Bond Elut C18固相萃取小柱。

噻苯咪唑、三唑醇、滅菌丹、咪酰胺購(gòu)于DIKMA公司；甲醇和乙腈均為色譜純，所用水為二次蒸餾水，其余試劑均為分析純，新疆吐魯番普通級(jí)葡萄干，購(gòu)自當(dāng)?shù)爻小?/p>

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱取噻苯咪唑、三唑醇、滅菌丹、咪酰胺，噻苯咪唑用甲醇溶解、其余均用乙腈溶解定容，配制成濃度均為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。用乙腈逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制系列工作溶液，冰箱4℃冷藏。

1.2 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱（5μm，250mm×4.6mm）；柱溫：室溫；流動(dòng)相：乙腈-甲醇-水體積比為=50∶10∶40；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：225 nm；流速1.0mL/min；進(jìn)樣量：10μL。采用色譜峰保留時(shí)間定性，外標(biāo)法峰面積定量。標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖如圖1所示。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of standard solution

1.3 樣品處理

葡萄干剪碎，準(zhǔn)確稱取2 g于研缽中，加入5 g無(wú)水硫酸鈉混合研磨，使葡萄干充分脫水并分散均勻后將其轉(zhuǎn)入離心管，加入9mL甲醇和乙腈混合萃取劑（v/v=1∶1），充分振搖，離心5min（3 000 r/min），上清液經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，置于10m L具塞錐形刻度管中，待C18固相萃取小柱凈化。

C18柱先用2m L甲醇活化，取樣品濾液混勻上樣，控制流速1mL/min，得到洗脫液8.0mL，移取2mL濾液在溫水中用微氮?dú)饬鳚饪s至0.2mL，取10μL進(jìn)行HPLC分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取條件優(yōu)化

2.1.1 分散劑用量選擇

本實(shí)驗(yàn)采用無(wú)水硫酸鈉作分散劑。當(dāng)葡萄干樣品量為2 g時(shí)，分別考察了2 g～7 g無(wú)水硫酸鈉作分散劑對(duì)樣品的分散能力和回收率的影響情況，如圖2所示。

圖2 分散劑用量的影響Fig.2 Influence of dispersion medium amount

結(jié)果表明，當(dāng)無(wú)水硫酸鈉為5 g時(shí)，樣品分散均勻，回收率較高。故選擇分散劑的用量為5 g。

2.1.2 萃取劑的選擇

由于4種防腐殺菌劑的溶解情況存在差異，很難用單一溶劑全部有效萃取，實(shí)驗(yàn)最后選定甲醇∶乙腈= 1∶1（v/v）混合溶劑作為萃取劑?？疾炝溯腿┯昧繉?duì)回收率的影響情況，如圖3所示。

圖3 萃取劑體積的影響Fig.3 Influence of extractant volume

結(jié)果表明，萃取劑的體積為9mL時(shí)，有最好的萃取效率。

2.1.3 固相萃取小柱的選擇

基質(zhì)固相分散甲醇萃取后，雜質(zhì)峰較多，干擾目標(biāo)化合物測(cè)定，必須進(jìn)一步凈化處理。分別考察了Florisil自裝柱和市售Varian Bond ElutC18固相萃取柱對(duì)葡萄干中4種防腐殺菌劑殘留的凈化洗脫情況。結(jié)果表明，過(guò)Florisil自裝柱后仍存在干擾且回收率低；而Varian Bond ElutC18固相萃取小柱，可有效截留住干擾組分，回收率也相對(duì)理想。故選擇Varian Bond ElutC18固相小柱凈化處理。

2.2 線性方程及檢出限

將標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋，配制成一系列濃度的工作液，在所選的色譜條件下，以Y（峰面積）對(duì)X（質(zhì)量濃度）繪制工作曲線，四組份的線性方程、相關(guān)系數(shù)及方法檢出限見(jiàn)表1。

表1 線性方程、相關(guān)系數(shù)和方法檢出限Table1 Linear equations，correlation coefficients and detection limits

2.3 加標(biāo)回收率和精密度

于2 g葡萄干樣品，加入適量標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最佳萃取條件和色譜條件下，測(cè)定加標(biāo)后四組分的含量，平行測(cè)定6次，計(jì)算相應(yīng)的回收率和精密度，結(jié)果見(jiàn)表2，樣品加標(biāo)色譜圖見(jiàn)圖4。

表2 樣品加標(biāo)回收率和精密度Table2 Recoveries and precision（n=6）

圖4 樣品加標(biāo)色譜圖Fig.4 Chromatogram of spiked sample

2.4 實(shí)際樣品測(cè)定

取2 g葡萄干樣品，在最佳萃取條件和色譜條件下測(cè)定，平行測(cè)定3次，實(shí)際樣品色譜圖如圖6所示，四組分均未檢出。

圖6 實(shí)際樣品色譜圖Fig.6 Chromatogram of the real sample

3 結(jié)論

采用固相分散萃取提取、C18小柱凈化、高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定葡萄干中4種防腐殺菌劑。無(wú)水硫酸鈉分散劑可有效破壞葡萄細(xì)胞和去除水分具有很好的分散效果，C18固相萃取柱凈化效果良好，方法適合于葡萄干中相關(guān)防腐殺菌劑的測(cè)定。

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Determination of Preservatives and Bactericides in Raisins by Solid Phase Extraction-Liquid Chromatography

SHI Long-mei，LI Huan，ZHOU Jian-ke*
（Research Center of Physics and Chemistry Analysis，Key Laboratory of Analytical Science and Technology of Hebei Province，Hebei University，Baoding 071002，Hebei，China）

With anhydrous sodium sulfate as dispersant，F(xiàn)our kinds of preservatives and bactericides in raisins were extracted by solid phase dispersion method，the C18 solid phase extraction small column was used for purification.Thiabendazole，Baytan，F(xiàn)olpet and Prochloraz were separated by reversed-phase high performance liquid chromatography with C18 column.The mobile phase was the mixture of acetonitrile，methanol and water（50∶10∶40，v/v）and detection wavelength was 225 nm.The linearity of regression equations were good in the range of 0.01μg/mL-200μg/mL，with correlation coefficients were greater than 0.999 3.Limit of detection is2.0 ng/g-20.0 ng/g.The relative standard deviations（RSD）were less than 3.18%．This method is suitable for the analysis of relevant preservatives and bactericides in raisins.

SPE；HPLC；thiabendazole；baytan；folpet；prochloraz

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.01.027

2013-11-14

史龍梅（1988—），女（漢），在讀碩士研究生，研究方向：色譜分離分析。

*通信作者：周建科（1956—），男，研究員，碩士生導(dǎo)師。