大海馬中總甾醇提取工藝優(yōu)化及成分分離

孫慧慧，劉長軍，顧青，傅玲琳，王彥波，*

（1.浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江杭州310018；2.象山縣水產(chǎn)技術(shù)推廣站，浙江象山315700）

大海馬中總甾醇提取工藝優(yōu)化及成分分離

孫慧慧1，劉長軍2，顧青1，傅玲琳1，王彥波1，*

（1.浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江杭州310018；2.象山縣水產(chǎn)技術(shù)推廣站，浙江象山315700）

根據(jù)香草醛-高氯酸顯色反應后樣品吸光度的差異，用Box-Behnken響應面法優(yōu)化了海馬中甾醇的提取條件。主要確定了提取溫度、提取時間及料液比3個因素對甾醇提取效果的影響。并以膽固醇為標準品，測定了海馬中總甾醇的含量。結(jié)果表明：提取溫度為79℃，提取時間為7.7h，料液比為80ml/g時，海馬中的總甾醇提取量最高，提取量為5.17mg/g。通過高效液相分析，初步分離海馬總甾醇提取物，為海馬中甾醇成分的提取和分離提供了初步的依據(jù)。

海馬；總甾醇；紫外分光光度法；高效液相；響應面

海馬（Hippocampusspp.）又被稱為龍落子，隸屬于海龍目（Syngnathiformes）海龍科（Syngnathidae）海馬屬（Hippocampus）[1]，是一種小型海產(chǎn)硬骨魚類[2]。在我國，海馬主要分布于東海及南海亞熱帶及溫帶海域[3]。中醫(yī)認為海馬具有補腎壯陽，舒筋活絡(luò)，散結(jié)消腫，止咳平喘的功效[4]，現(xiàn)代研究表明海馬的激素樣作用、提高免疫力等[5-7]功效與其所含的化學成分相關(guān)。許東暉等[8]曾指出主要為膽甾醇類，膽甾烯類等甾體化合物，構(gòu)成了海馬類藥材補腎壯陽的基礎(chǔ)。例如膽甾醇在睪丸內(nèi)經(jīng)一系列酶的催化作用可轉(zhuǎn)化為睪酮，是性激素的前體。海馬中的其他成分也可能與其性激素樣作用相關(guān)。張前進[9]曾指出脂肪酸類物質(zhì)如DHA是前列腺及精子的物質(zhì)基礎(chǔ)，為海馬類藥物的補腎作用提供一定參考價值。同時海馬中含有大量的鈉、錳、鋅等微量元素，與其抗衰老，補腎等藥理效果也是一致的。許益民等[10]認為磷脂具有補腎壯陽、提高免疫力等功效，同時與機體的生殖及激素代謝，與海馬的功效吻合。近年來，大海馬因體型大，經(jīng)濟價值高等優(yōu)點，常見于中藥材店。本文以大海馬為實驗材料，旨在考察海馬中總甾醇的提取率及后續(xù)活性成分的分離純化，為大海馬成分及功效原理的研究提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

實驗所用大海馬購自寧波大學海馬養(yǎng)殖試驗基地，個體濕重（5±0.5）g。

無水乙醇、乙醚、氫氧化鉀、冰乙酸、香草醛、高氯酸、甲醇（分析純）、乙腈（分析純）、異丙醇（分析純），以上試劑除特殊標注外，均為分析純，購于杭州雙天生物公司。膽固醇標準品購于上海金穗生物科技有限公司。

1.2 實驗儀器

SCT-06索氏提取器：杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；HH-S數(shù)顯水浴鍋：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；UV-2550紫外可見分光光度儀：SHIMADZ；VersaMaxTM酶標儀：Molecular Devices；Agilent1100高效液相色譜儀：AGILENT；AB135-S分析天平：METTLER TOLEDO。

1.3 實驗方法

1.3.1 膽甾醇標準曲線的繪制

實驗選取動物甾醇對照品膽甾醇為標準，繪制標準曲線。準確稱取27.00mg膽甾醇于50mL容量瓶中，加入無水甲醇定容。帶樣品充分溶解混勻后，分別取0.10、0.30、0.50、0.60、0.80、1.00mL于試管中，80℃水浴揮干溶劑，分別加入0.2mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8mL高氯酸，70℃下顯色30min，冰浴迅速冷卻，加入4.0mL冰醋酸，充分混勻，用酶標儀在545 nm波長下測定其吸光度值。以吸光值為橫坐標，膽甾醇含量為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.2 海馬甾醇樣品的提取制備

準確稱取海馬樣品1.00 g，粉碎后加入一定比例的無水乙醇溶液，用索氏抽提儀提取。回收溶劑后，將提取液移至圓底燒瓶中，減壓干燥，除去溶劑。加入20 mLKOH-CH3OH溶液，于60℃水浴皂化3 h后，冷卻，加入40mL蒸餾水，混勻，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用乙醚萃取3次，每次20mL，合并乙醚萃取液，用飽和NaCl溶液洗滌2次，以無水Na2SO4干燥乙醚萃取液，并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干乙醚溶劑。將提取物溶于10mL無水乙醇溶液中，搖勻，取1mL該溶解液于試管中，蒸干溶劑，按香草醛-高氯酸顯色法測定該樣品吸光度。根據(jù)膽甾醇的標準曲線，計算出樣品中的總甾醇含量。

1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 提取溫度對海馬總甾醇提取量的影響

稱取6份海馬粉碎物1.00 g，加入90mL無水乙醇，分別于40、50、60、70、80、90℃條件下抽提6 h，回收溶劑后按1.3.2的步驟皂化后，按5%香草醛-高氯酸顯色法在545 nm波長下測定其吸光度。有標準曲線法計算不同提取溫度下海馬總甾醇的提取量。

1.3.3.2 提取時間對海馬總甾醇提取量的影響

稱取6份海馬粉碎物1.00 g，加入90mL無水乙醇，在70℃的提取溫度下，分別抽提3、4、5、6、7、8 h后，以相同的方法測定不同提取時間下海馬總甾醇的提取量。

1.3.3.3 料液比對海馬總甾醇提取量的影響

稱取6份海馬粉碎物1.00 g，在70℃的提取溫度下，分別按料液比1∶50，1∶60，1∶70，1∶80，1∶90，1∶100加入不同量的無水乙醇，索氏抽提7 h后，回收溶劑，皂化出去提取液中的脂肪酸成分，根據(jù)其吸光值判斷不同料液比對海馬總甾醇的提取量的影響。

1.3.4 響應面設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選定提取溫度，提取時間和料液比的范圍，根據(jù)Design-Expert.V8.0.6的Boxbehnken中心組合原理，對3個自變量分別選取3個水平編碼為-1，0，1，以海馬總甾醇提取量為因變量設(shè)計實驗組合，確定海馬總甾醇的最有提取方案。實驗因素及水平見表1。

表1 響應面法提取海馬總甾醇的因素和水平Table1 Facts and levels in respond surface design

1.3.5 海馬甾醇提取物的高效液相分離

采用配備紫外檢測器的Agilent1100型液相色譜儀分離其甾醇提取物，具體實驗方法為：取適量海馬總甾醇提取物，以色譜純甲醇溶解，過0.22μm有機膜后，裝入液相樣品瓶中備用。以乙腈，水，異丙醇為洗脫劑，探討海馬甾醇的分離條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長的確定

取任意未皂化樣品組1.0mL溶液及0.5mL膽甾醇標準品溶液分別加入試管中，80℃水浴揮干溶劑，加入0.2mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8mL高氯酸，70℃下顯色30min，冰浴迅速冷卻，加入4.0mL冰醋酸，充分混勻，分別用紫外分光光度計在300 nm～900 nm進行波長掃描，結(jié)果顯示未皂化樣品的最大吸收波長為532 nm，標準品的最大吸收波長為545 nm，二者相差過大，不能確定選用的最大吸收波長[11-12]。所以對樣品進行造化處理，其具體實驗步驟為：提取液減壓干燥后，加入20mLKOH-CH3OH溶液，于60℃水浴皂化3 h后，冷卻，加入40mL蒸餾水，混勻，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用乙醚萃取3次，每次20mL，合并乙醚萃取液，用飽和NaCl溶液洗滌2次，以無水Na2SO4干燥乙醚萃取液，并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干乙醚溶劑。再將提取物溶于10mL無水乙醇溶液中，按同樣步驟進行顯色和波長掃描。結(jié)果顯示，皂化樣品和標準品均在545 nm處有最大吸光值，所以選定545 nm為甾醇含量測定波長，并且樣品液需進行皂化處理。

2.2 標準曲線

按1.3.1所述方法配置和移取膽甾醇標準品溶液，用酶標儀預讀各酶標板孔的吸光值，扣除空白，平行加樣3次，取吸光度平均值為x軸，膽甾醇提取量為y軸作出膽甾醇標準曲線，如圖1所示。

圖1 膽甾醇標準曲線Fig.1 Standard curveof cholesterol

標準曲線的線性回歸方程為y=4.788 9x-0.017 4（R2=0.998 7）根據(jù)該方程可知，樣品中膽甾醇提取量（mg/g）=10×（4.788 9A-0.017 4）/m。式中：A為吸光度；m為海馬粉碎物的質(zhì)量，g。

2.3 單因素實驗

2.3.1 提取溫度

當提取時間為6 h，料液比為90mL/g時，不同溫度下海馬總甾醇的提取量見圖2。

由圖2可知，隨著溫度的增加，海馬總甾醇提取量逐漸增大；在60℃～70℃范圍內(nèi)，總甾醇提取量顯著升高；當溫度高于70℃，總甾醇提取量增長速度減緩。因此，最佳提取溫度為70℃。

圖2 溫度對總甾醇提取量的影響Fig.2 Effect of extracting temperature on the yield of total sterol

2.3.2 提取時間

由溫度單因素試驗結(jié)果選定提取溫度為70℃，料液比為90mL/g，3 h～8 h內(nèi)不同提取時間對海馬總甾醇提取量的影響見圖3。

圖3 時間對總甾醇提取量的影響Fig.3 Effect of extracting time on the yield of total sterol

當提取時間小于5 h時，提取量隨提取時間的增長而緩慢增加；在5 h～7 h內(nèi)，甾醇提取量增長迅速；當提取時間高于7 h時，甾醇提取量增幅較小，趨于穩(wěn)定。由圖3可知，7 h的提取效果較理想。

2.3.3 料液比

根據(jù)提取溫度和提取時間的單因素試驗結(jié)果，選定提取溫度為70℃，提取時間為7 h，料液比為1∶50、1∶60、1∶70、1∶80、1∶90、1∶100mL/g時的甾醇提取量結(jié)果如圖4所示。

圖4 料液比對總甾醇提取量的影響Fig.4 Effect of alcohol/seahorse ratio on the yield of total sterol

由圖4可見，隨著料液比的增加，甾醇提取量增加，且增幅逐漸增大?？赡苁且驗殡S著料液比的增加，甾醇的溶出總量增加，但總?cè)艹隽康脑黾铀俣刃∮谔崛∫后w系體積增大速度，使得提取液濃度減小，傳質(zhì)推動力的作用下，甾醇的總?cè)艹隽靠焖僭黾?。但根?jù)低能耗、低消費及環(huán)保的實驗原則，最優(yōu)料液比選為80mL/g。

2.4 響應面分析

2.4.1 響應面實驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選定提取溫度、提取時間和料液比3個因素，確定其不同的取值范圍，根據(jù)Box-benhnken中心組合實驗設(shè)計原理，以海馬總甾醇提取量為響應值，其設(shè)計方案及結(jié)果見表2。

表2 Box-beknhen試驗設(shè)計及結(jié)果Table2 Design and results of Box-beknhen experiment

2.4.2 模型及顯著性檢驗

根據(jù)響應面分析結(jié)果，得到海馬總甾醇提取量的回歸方程：海馬總甾醇提取量（mg/g）=4.85+0.38A+ 0.74B+0.62C+0.32AB+0.17AC+0.40BC-0.78A2-0.63B2-0.10C2（R2=0.972 2），其中A為提取溫度/℃，B為提取時間/h，C為料液比/（mL/g）。根據(jù)表3可知，該模型為極顯著（Pr＞F值為0.000 1小于0.01），失擬項為不顯著（Pr＞F值為0.096 3大于0.05），所以該模型對實驗結(jié)果擬合性較好，即該模型可用于預測實驗結(jié)果。另外本模型的變異系數(shù)（C.V.%值）為5.86，表明模型的置信度較高，表明該模型的預測值的準確性，在所取實驗條件范圍內(nèi)，可反映出甾醇提取量的變化[13]。由表3也可看出，甾醇提取量與A、B、C、A2、B2呈極顯著的相關(guān)性，與AB，BC項呈顯著相關(guān)。根據(jù)F值大小，可得出各因素對甾醇提取量的影響大小關(guān)系為：提取時間一次項＞料液比一次項＞提取溫度二次項＞提取時間二次項＞提取溫度一次項＞提取時間與料液比交互項＞提取溫度與時間交互項。

表3 試驗結(jié)果方差分析Table3 Variance analysis table of the test results

2.4.3 響應面及等高線分析

各因素間的交互作用效果可通過響應面以及等高線圖觀察。響應面的坡度反映了海馬甾醇提取量對因素變化的靈敏程度。等高線形狀表明兩因素的交互作用明顯程度，等高線為橢圓形，兩因素交互作用明顯；等高線圖越接近圓形，則兩因素的交互作用越不明顯[14]。海馬甾醇提取的3個因素交互作用的響應面圖見圖5～圖7。圖5為料液比為80mL/g時，提取溫度和提取時間交互作用效果。響應面坡度較陡，其交互作用對海馬甾醇提取量有一定的影響。根據(jù)等高線的分布，可知海馬甾醇提取量受提取時間的影響較大。提取時間為7 h，料液比和提取溫度的交互作用效果見圖6。其響應面較平緩，兩因素的交互作用對甾醇提取量的影響不明顯，料液比對甾醇提取量的影響略大于提取溫度。圖7則表明提取溫度恒定時，提取時間和料液比的交互作用對還馬總甾醇提取量有影響，且料液比的影響作用明顯高于提取時間。

圖5 提取溫度和提取時間對海馬總甾醇提取量影響的響應面圖Fig.5 Response surface plots of extracting temperature and extracting time on the yield of total sterol in seahorse

圖6 提取溫度和料液比對海馬總甾醇提取量影響的響應面圖Fig.6 Response surface plots of extracting temperature and liquid-to-solid ratio on the yield of total sterol in seahorse

2.5 高效液相分離結(jié)果與分析

對所提取海馬總甾醇采用高效液相色譜法進行分離。通過樣品全波長掃描，確定其最大吸收波長為205 nm，與甾醇類物質(zhì)的最大吸收波長相同，表明樣品中主要成分為甾醇。其最終分離條件為：

圖7 提取時間和料液比對海馬總甾醇提取量影響的響應面圖Fig.7 Response surface plots of extracting time and liquid-to-solid ratio on the yield of total sterol in seahorse

色譜柱：C18，4.6×250mm，5μm（Thermo Hypersil BDS，USA）；

流動相：由23%乙腈，70%水和7%異丙醇組成的混和液，用于平衡、洗脫；

上樣量：10μL；流速：1mL/min；柱溫：30℃；

檢測器：紫外可變波長檢測器；檢測波長：205 nm。

海馬甾醇的分離圖譜見圖8所示。由圖可知，提取物所含物質(zhì)種類較多，為5～8種；但其中某種甾醇類成分峰形高且尖，含量相對較高，易于與其他成分分離。

3 結(jié)論

1）本文綜合了海馬總甾醇的提取的3個主要影響因素，根據(jù)單因素實驗探討其與海馬甾醇提取量的關(guān)系，最終通過響應面分析，得到數(shù)據(jù)模型，確定了最有提取方法為：提取溫度：79℃，提取時間：7.7 h，料液比：80mL/g，甾醇提取量：5.17mg/g。

2）通過高效液相色譜分析，確定其甾醇物質(zhì)的分離條件?？鄢軇┓搴?，提取物中含有5-8中含量較高的成分，為后續(xù)甾醇成分確定及其功效研究提供一定依據(jù)。

圖8 海馬總甾醇提取物的高效液相分離圖Fig.8 The HPLC figure of total sterol in seahorse

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Optimization of Extracting Conditions and Component Analysis of Total Sterol in the Hippocampus kuda

SUN Hui-hui1，LIU Chang-jun2，GU Qing1，F(xiàn)U Ling-lin1，WANG Yan-bo1，*
（1.School of Food Science and Biotechnology，Zhejiang Gongshang University，Hangzhou 310018，Zhejiang，China；2.Xiangshan Aquaculture Technology Extending Stations，Xiangshan 315700，Zhejiang，China）

In the present work，we optimized the extracting conditions of total sterol in Hippocampus kuda by Box-Behnken response surface method according to the difference in absorbance of vanillin perchloric acid color reaction.Three factors associated with extraction effect were determined，including extraction temperature，extraction time and ratio of material to liquid.The content of total sterol in the hippocampus was also determined with a standard of cholesterol.The results showed that the highest total sterol extraction amount was obtained to 5.17mg/g when the extraction temperature was at79℃，extraction time at 7.7 h，and the ratio of solid to liquid at 80 mL/g.The purified sample was further identified by high performance liquid chromatography（HPLC）.This paper provided a preliminary basis for the extraction and separation of the sterol composition in Hippocampus kuda.

Hippocampus kuda；total steroid；UV spectrophotometry；high performance liquid chromatography（HPLC）；response surface method

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.01.012

2014-09-22

國家海洋經(jīng)濟創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項項目和寧波市科技計劃重大專項（寧波市農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項目）（2014C10006）

孫慧慧（1989—），女（漢），碩士生，研究方向：水產(chǎn)品活性物質(zhì)及作用。

*通信作者：王彥波，教授，博士。