青霉噻唑酸表面分子印跡聚合物的制備及其吸附性能的考察

鄭鵬磊， 羅智敏， 暢瑞苗， 葛燕輝， 杜 瑋， 常 春， 傅 強(qiáng)

（西安交通大學(xué)藥學(xué)院，陜西 西安710061）

1928 年，F(xiàn)leming 發(fā)現(xiàn)了青霉素，隨后青霉素一直廣泛應(yīng)用于臨床，挽救了無數(shù)人的生命。青霉素具有抗菌能力強(qiáng)、高效、廉價等優(yōu)點(diǎn)，然而其過敏反應(yīng)的發(fā)生率居各類藥物首位，被視為世界性醫(yī)學(xué)難題［1，2］。近年來國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)致敏原并非青霉素藥物本身，而是在合成、儲存或使用過程中，在潮解、受熱、pH 變化或酶的作用下，青霉素的β-內(nèi)酰胺環(huán)易于開環(huán)產(chǎn)生青霉噻唑酸（penicilloic acid，PEOA）及多聚物等雜質(zhì)［3］。青霉噻唑酸在體內(nèi)易與蛋白質(zhì)或多糖結(jié)合形成全抗原，激發(fā)T 細(xì)胞，從而誘發(fā)過敏反應(yīng)，嚴(yán)重者甚至導(dǎo)致休克或死亡［4］。青霉素類抗生素被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)，然而青霉素進(jìn)入動物體內(nèi)，經(jīng)肝臟代謝可產(chǎn)生青霉噻唑酸并在肝臟蓄積，食用此類動物源食品對人們的身體健康具有潛在危害，嚴(yán)重影響食品的質(zhì)量和安全［5］。因此建立快速有效的青霉噻唑酸分離分析方法，對提高青霉素藥物的安全性、減少過敏反應(yīng)的發(fā)生和檢測食品中抗生素的殘留有重要意義。

目前已有報道的青霉噻唑酸分析方法有薄層色譜法［6］、高效液相色譜法［7，8］、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［9，10］、酶聯(lián)免疫吸附法［11］等。此外，樣品的前處理技術(shù)對于復(fù)雜樣品的高靈敏度檢測尤為重要，傳統(tǒng)的前處理技術(shù)有液-液萃取、固相萃取（solid phase extraction，SPE）等，然而常用的萃取介質(zhì)如C8、C18 等存在特異性識別差、回收率低、內(nèi)源性雜質(zhì)干擾嚴(yán)重等問題，導(dǎo)致分析結(jié)果存在重復(fù)性差、專屬性不強(qiáng)和準(zhǔn)確度不高的問題。近年來，為了滿足高選擇性的需求，新的萃取介質(zhì)如分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymers，MIPs）受到了廣泛關(guān)注［12-15］，分子印跡聚合物具有特異識別性、廣泛實用性和構(gòu)效預(yù)定性等優(yōu)點(diǎn)，將分子印跡聚合物用于固相萃取介質(zhì)可特異性識別復(fù)雜樣品中的目標(biāo)分子，實現(xiàn)對目標(biāo)分子及其結(jié)構(gòu)類似物的選擇性富集和分離。

分子印跡聚合物的制備方法主要有本體聚合法、沉淀聚合法和懸浮聚合法等，然而這些聚合方法存在模板分子難以洗脫、印跡位點(diǎn)包埋過深、吸附速率慢、結(jié)合容量低等缺點(diǎn)［16］。近年來研究發(fā)現(xiàn)以表面聚合法制備的聚合物具有特異的選擇性、更易接近的結(jié)合位點(diǎn)、快速的傳質(zhì)速率和較高的結(jié)合動力學(xué)等優(yōu)點(diǎn)，表面聚合法已日益成為分子印跡領(lǐng)域的主要聚合技術(shù)［13，15，17］。

本研究采用表面印跡聚合法，以青霉噻唑酸為模板分子，甲基丙烯酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，甲醇／乙腈為溶劑，在改性硅膠表面制備青霉噻唑酸分子印跡聚合物，并對模板分子-功能單體摩爾比、交聯(lián)度和溶劑等聚合條件進(jìn)行優(yōu)化。利用掃描電鏡、紅外光譜、元素分析和熱重分析對聚合物形貌和物理特性進(jìn)行表征。結(jié)合高效液相色譜法（HPLC），采用靜態(tài)吸附、吸附動力學(xué)及選擇性吸附實驗對青霉噻唑酸分子印跡聚合物的吸附性能進(jìn)行考察。所制備的分子印跡聚合物用于固相萃?。∕ISPE），為建立青霉素類藥物和食品中致敏性雜質(zhì)青霉噻唑酸的分離分析方法奠定了基礎(chǔ)，實現(xiàn)青霉素藥物的安全性評價和食品中青霉素殘留的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

青霉噻唑酸（按照已報道的合成方法［18，19］自制）；青霉素G（penicillin G，純度＞97%）、6-氨基青霉烷酸（6-aminopenicilanic acid，純度＞99%）、美洛西林（mezloeillin，純度＞98%）、氯唑西林（cloxacillin，純度＞97%）、奧拉西坦（oxiracetam，純度＞94%）均購于西安仁達(dá)生物科技有限公司；乙二酸二甲基丙烯酸酯（ethylene glycol dimethacrylate，EGDMA，美國Sigma 公司，分析純）使用前經(jīng)堿液萃?。患谆┧幔╩ethacrylic acid，MAA，天津市化學(xué)試劑研究所，分析純）使用前經(jīng)減壓蒸餾處理；偶氮二乙丁腈（2，2′-azobisisobutyronitrile，AIBN，上海試劑四廠，化學(xué)純）使用前經(jīng)甲醇重結(jié)晶；3-氨丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyltriethoxysilane，APTES，北京百靈威化學(xué)有限公司，化學(xué)純）；磷酸氫二銨、磷酸、鹽酸（北京化工廠）；硅膠（粒徑：100 μm，Tokyo Chemical Industry Co.，Ltd，日本）；三蒸水（Molelement 1805b 元素型超純水機(jī)，上海摩勒生物科技）；其余試劑均為分析純或色譜純。

Shimadzu 色譜系統(tǒng)包括LC-20AT 泵、SPD-20A 紫外檢測器、CBM-102 實時分析色譜工作站；AUY220 型電 子天平（日本 Shimadzu 公 司）；Mettler Toledo pH 計（德國梅特勒-托利多集團(tuán)）；Thermo Nicolet Nexus 330 FT-IR Spectrometer（美國Madison 公司）；TM-1000 Scanning Microscope（日本Hitachi 公司）；EL3 Elementary Analyser （德國Elementar 公司）；SDT Q600 Thermogravimetric Analyzer （美 國 TGA 公 司）；KQ3200DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；101-2AB 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 HPLC 條件

色譜柱：Promosil C18 柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-磷酸氫二銨溶液（0.05 mol／L，pH 6.18）（15 ∶85，v／v），過濾并超聲后使用；流速：0.8 mL／min；檢測波長：225 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3 青霉噻唑酸分子印跡聚合物的制備

采用表面印跡聚合法，以PEOA 為模板分子，MAA 為功能單體，EGDMA 為交聯(lián)劑，甲醇／乙腈為溶劑，在改性硅膠表面制備青霉噻唑酸分子印跡聚合物（PEOA-MIPs）。

1.3.1 硅膠的活化

稱取球形硅膠約6 g，分散于50 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% 的HCl 溶液中，在110 ℃下加熱攪拌回流24 h，然后用大量水洗至中性，60 ℃下干燥24 h。

1.3.2 硅膠的改性

稱取活化硅膠約5 g 于100 mL 圓底燒瓶中，依次加入甲苯50 mL、APTES 2 mL 和三乙胺1 mL，110 ℃下加熱攪拌回流24 h。反應(yīng)后用甲醇洗去未反應(yīng)試劑，60 ℃下干燥24 h 即得改性硅膠（SiO2-APTES）。

1.3.3 PEOA-MIPs 的制備

稱取0.5 mmol PEOA 于10 mL 甲醇中，超聲溶解后加10 mL 乙腈，加入功能單體MAA 168 μL（PEOA 和MAA 的摩爾比為1 ∶4）和SiO2-APTES 2 g，25 ℃下攪拌12 h 進(jìn)行預(yù)組裝。再加入交聯(lián)劑EGDMA 952 μL（交聯(lián)度85%）和引發(fā)劑AIBN 0.016 4 g，超聲分散20 min 后通氮?dú)?0 min，密封后于60 ℃下水浴反應(yīng)24 h。將反應(yīng)產(chǎn)物減壓抽濾，并用大量甲醇洗滌，丙酮漂洗。甲醇-冰醋酸（4 ∶1，v／v）索氏洗脫24 h 以除去模板分子，然后依次用乙腈-水（20 ∶80，v／v）、甲醇洗滌，干燥得青霉噻唑酸表面分子印跡聚合物（PEOA-MIPs）。

制備青霉噻唑酸非印跡聚合物（PEOA-NIPs），除不加入模板分子PEOA 外，其他步驟同上。

1.4 聚合物形貌和物理特性的表征

采用掃描電子顯微鏡對活化硅膠和聚合物進(jìn)行觀察，以獲取樣品表面形貌信息。采用KBr 壓片法分別對活化硅膠、改性硅膠和PEOA-MIPs 進(jìn)行紅外光譜分析。采用熱重分析儀分別測定活化硅膠、改性硅膠及印跡聚合物的熱重曲線，并根據(jù)相對重量損失計算硅膠表面的聚合物層的重量（公式（1））。對分子印跡聚合物進(jìn)行元素分析，并根據(jù)元素分析結(jié)果計算聚合物層的厚度（公式（2）、（3））［20］。

其中：mMIPs為硅膠表面聚合物層的質(zhì)量（mg）；ms為硅膠的質(zhì)量（g）；loss 為由熱重分析所得的質(zhì)量損失；C 為聚合物層的含碳量；mC為每克硅膠表面聚合物層所含碳的質(zhì)量（g）；Mw為聚合物層的加權(quán)平均相對分子質(zhì)量；MC為聚合物層中碳原子的加權(quán)平均相對分子質(zhì)量；ρ 為加權(quán)平均密度（g／mL）；S 為硅膠比表面積（m2／g）；d 為聚合物層的厚度（nm）。

1.5 聚合物吸附性能的考察

1.5.1 靜態(tài)吸附實驗

精密稱定PEOA-MIPs 和PEOA-NIPs 各20.0 mg，置于10 mL 錐形瓶中，加入10 ～800 μg／mL 的PEOA 系列溶液各10 mL，25 ℃恒溫空氣浴振蕩1 h，吸取上清液經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾后進(jìn)行HPLC 分析。根據(jù)吸附前后PEOA 濃度的變化計算聚合物對PEOA 的吸附量Q（公式（4）），并用Langmuir（公式（5）［21］）與Freundlich（公式（6）［22］）兩種模型分析靜態(tài)吸附數(shù)據(jù)。

其中：C0為吸附前溶液中PEOA 的質(zhì)量濃度（μg／mL）；Ce為吸附后溶液中PEOA 的平衡質(zhì)量濃度（μg／mL）；V 為PEOA 溶液的體積（mL）；W為PEOA-MIPs 或PEOA-NIPs 的質(zhì)量（mg）；Qe為聚合物層的吸附量（mg／g）；KL為Langmuir 吸附分配系數(shù)（L／mg）；Qm為聚合物層的最大吸附量（mg／g）；KF和n 均為Freundlich 參數(shù)。

1.5.2 吸附動力學(xué)實驗

精密稱定PEOA-MIPs 和PEOA-NIPs 各20.0 mg，置于10 mL 錐形瓶中，分別加入400 μg／mL PEOA 溶液10 mL，25 ℃恒溫空氣浴分別振蕩1、5、10、15、30、45、60、90、120 min。吸取上清液經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾后進(jìn)行HPLC 分析。

將吸附動力學(xué)數(shù)據(jù)用準(zhǔn)一級動力學(xué)方程（公式（7））和準(zhǔn)二級動力學(xué)方程（公式（8））分析［23，24］：

其中：Qe為平衡吸附量（mg／g）；Qt為t 時刻的吸附量（mg／g）；k1為準(zhǔn)一級動力學(xué)方程吸附速率常數(shù)（min-1）；k2為準(zhǔn)二級動力學(xué)方程吸附速率常數(shù)（g／（mg·min））。

1.5.3 吸附選擇性實驗

精密稱定PEOA-MIPs 和PEOA-NIPs 各20.0 mg，置于10 mL 錐形瓶中，分別加入400 μg／mL 青霉素G、6-氨基青霉烷酸、美洛西林、氯唑西林和奧拉西坦溶液各10 mL，25 ℃下恒溫空氣浴振搖1 h，吸取上清液經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾后進(jìn)行HPLC分析。

1.6 MISPE-HPLC 檢測豬肝中青霉噻唑酸的前處理方法

稱取150 mg PEOA-MIPs 裝入2.5 mL 固相萃取空柱，柱底端和頂端均加封聚丙烯篩板，依次用6 mL 甲醇和6 mL 水沖洗。取空白豬肝臟樣品2.0 g，加入4 mL 生理鹽水勻漿處理，并精密吸取不同濃度青霉噻唑酸溶液200 μL 至勻漿液中，超聲分散后加入6 mL 乙腈沉淀蛋白質(zhì)，于8 000 r／min 下離心10 min，上清液再于12 000 r／min 下離心5 min。取上清液1 mL 上樣，用1 mL 異丙醇淋洗雜質(zhì)，再用3 mL 甲醇-10% 冰醋酸（9 ∶1，v／v）洗脫，收集洗脫液并用氮?dú)獯蹈桑? mL 水復(fù)溶后經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后進(jìn)行HPLC 分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 分子印跡聚合物的制備

青霉噻唑酸分子印跡聚合物的制備流程如圖1所示。硅膠顆粒經(jīng)過酸活化處理，使其表面含有羥基基團(tuán)?；罨枘z與APTES 發(fā)生反應(yīng)，將氨基基團(tuán)接枝在硅膠表面。加入的PEOA 和MAA 通過羧基和硅膠表面的氨基相互作用，從而在硅膠表面發(fā)生聚合反應(yīng)，使聚合物層包覆在硅膠表面，洗脫模板后，形成青霉噻唑酸表面分子印跡聚合物。

圖1 青霉噻唑酸分子印跡聚合物的制備流程Fig.1 Preparation process of PEOA-MIPs

在制備過程中功能單體MAA 可能與模板分子PEOA 形成氫鍵，合適的模板分子-功能單體摩爾比有利于聚合物具有更好的特異識別能力和吸附特性；交聯(lián)劑使模板分子和功能單體聚合形成高度交聯(lián)、剛性的聚合物，在選擇交聯(lián)度時，既要使聚合物具有一定的剛性以保持良好的空間構(gòu)型，又要具有一定的柔韌性以便易于接近其識別位點(diǎn)，從而具有良好的識別性能。理想的溶劑不但有助于模板分子和其他反應(yīng)物的溶解，還可能在一定程度上促進(jìn)模板分子與功能單體之間的相互作用。因此為了使分子印跡聚合物具有最佳的吸附能力，分別對青霉噻唑酸分子印跡聚合物的制備條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果見圖2。

從圖2a 中可以看出，隨著MAA 的增加，PEOAMIPs 的吸附量逐漸增加；但當(dāng)MAA 用量過多時，功能單體會趨于自聚合而形成較多的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致印跡因子（IF）下降。當(dāng)模板分子與功能單體的摩爾比為1 ∶4 時，所合成的聚合物有良好的識別能力與吸附能力，為最佳比例。從圖2b 中可以看出，交聯(lián)度為85% 時，聚合物對PEOA 的吸附量和印跡因子均相對最高，因此制備PEOA-MIPs 的最佳交聯(lián)度為85%。從圖2c 中可以看出，當(dāng)甲醇與乙腈的體積比為3 ∶1 時，所合成的聚合物具有相對好的印跡因子，但吸附量較低；當(dāng)甲醇與乙腈的體積比為1 ∶1 時，所合成的聚合物具有相對好的印跡因子和相對較高的吸附量，此時溶劑的極性有利于模板分子與功能單體之間氫鍵作用力的形成，因此甲醇-乙腈（1 ∶1，v／v）為最佳溶劑。綜上，PEOAMIPs 的最優(yōu)制備條件為PEOA／MAA 的摩爾比為1∶4，交聯(lián)度為85%，溶劑為甲醇-乙腈（1 ∶1，v／v）。

圖2 不同制備條件對PEOA-MIPs 吸附性能的影響Fig.2 Effect of different preparation conditions on adsorption capacity of PEOA-MIPs

2.2 聚合物形貌和物理特性的表征

2.2.1 掃描電鏡分析

借助掃描電子顯微鏡分別對活化硅膠和聚合物的表面形貌進(jìn)行了觀察，結(jié)果見圖3。與活化硅膠（見圖3a）相比，PEOA-MIPs（見圖3b）和PEOANIPs（見圖3c）的表面更粗糙，表明聚合物層在硅膠表面接枝成功，而PEOA-MIPs 和PEOA-NIPs 并無明顯差異。

2.2.2 熱重分析

圖3 （a）活化硅膠、（b）PEOA-MIPs 和（c）PEOA-NIPs的掃描電鏡圖Fig.3 SEM images of （a）activated silica gels，（b）PEOA-MIPs and （c）PEOA-NIPs

圖4 （a）活化硅膠、（b）改性硅膠、（c）PEOA-MIPs 和（d）PEOA-NIPs 的熱重分析曲線Fig.4 TGA curves of （a）activated silica gels，（b）SiO2-APTES，（c）PEOA-MIPs and（d）PEOA-NIPs

活化硅膠、改性硅膠及印跡聚合物在25 ～800℃溫度區(qū)間的熱重曲線見圖4。隨著溫度的升高，活化硅膠和改性硅膠僅少量失重，在800 ℃時活化硅膠失重7.4%，改性硅膠失重10.7%，3.3% 的差額可能為所接枝APTES 的質(zhì)量損失，表明氨基成功接枝在活化硅膠表面。PEOA-MIPs 和PEOANIPs 的熱重曲線較為相似，在25 ～260 ℃范圍內(nèi)均較穩(wěn)定；之后在260 ～600 ℃范圍內(nèi)均有較大的質(zhì)量損失，隨后曲線趨于平坦，在800 ℃時PEOA-MIPs和PEOA-NIPs 的總失重分別為29.0% 和38.4%，硅膠表面MIPs 層的重量約為224.0 mg／g。表明聚合物層在硅膠表面接枝成功，并且在25 ～260 ℃具有很好的熱穩(wěn)定性。

2.2.3 紅外光譜分析

活化硅膠、改性硅膠、PEOA-MIPs 的紅外光譜分析結(jié)果見圖5。圖5a 中3 461 cm-1處的吸收峰為活化硅膠表面O-H 的伸縮振動峰；圖5b 中1 096和3 446 cm-1處為APTES 中C-N 和N-H 的伸縮振動峰，表明硅膠表面成功接枝上-NH2基團(tuán)；圖5c中1 109 cm-1為EGDMA 中C-O 的伸縮振動峰，1 563 cm-1處為聚合物骨架上-CH3的伸縮振動峰，1 727 cm-1處的強(qiáng)吸收峰可能為MAA 或EGDMA中C＝O 的伸縮振動峰，相比圖5b 中N-H 的伸縮振動峰變寬，說明聚合物中有氫鍵作用存在，結(jié)果表明聚合物成功包覆在硅膠表面。

圖5 （a）活化硅膠、（b）改性硅膠和（c）印跡聚合物的紅外光譜圖Fig.5 FTIR spectra of （a）activated silica gels，（b）SiO2-APTESand （c）PEOA-MIPs

2.2.4 元素分析

對分子印跡聚合物進(jìn)行元素分析，結(jié)果見表1。C 和N 元素在聚合物中出現(xiàn)，且MIPs 和NIPs 中碳的含量均較大，經(jīng)計算得MIPs 和NIPs 的聚合物層厚度（d）分別約為2.17 和3.13 nm，表明功能單體和交聯(lián)劑已接枝到硅膠表面，在硅膠表面附著一定厚度的聚合物。

表1 PEOA-MIPs 和PEOA-NIPs 的元素分析結(jié)果Table 1 Results of elemental analysis of PEOA-MIPs and PEOA-NIPs

2.3 聚合物吸附性能的考察

2.3.1 靜態(tài)吸附實驗

為考察聚合物層的吸附性能，采用靜態(tài)吸附實驗分別測定了PEOA-MIPs、PEOA-NIPs 和聚合物層的等溫吸附曲線，結(jié)果分別見圖6a、c。隨著溶液中PEOA 濃度的增加，聚合物層的吸附量均增加，當(dāng)溶液濃度增加至600 μg／mL，聚合物層的吸附位點(diǎn)趨于飽和，從而使吸附處于平衡狀態(tài)，MIPs 和NIPs 聚合物層的飽和吸附量分別為122.78 和19.44 mg／g。在整個吸附過程中，PEOA-MIPs 的吸附量明顯大于PEOA-NIPs，表明PEOA-MIPs 對PEOA 有特異的吸附能力。在PEOA-MIPs 制備過程中，PEOA 與MAA 之間形成氫鍵、靜電作用力等非共價作用力，從而使在硅膠表面形成了能與模板分子PEOA 相匹配且具有特異識別位點(diǎn)的三維孔穴結(jié)構(gòu)，因此PEOA-MIPs 除有同PEOA-NIPs 一樣的非特異性吸附外，還存在對模板分子的特異性吸附位點(diǎn)。

將聚合物層的等溫吸附數(shù)據(jù)用Langmuir 與Freundlich 兩種模型進(jìn)行分析，結(jié)果見表2。Langmuir 相比Freundlich 方程有更好的相關(guān)系數(shù)（R2），聚合物層對PEOA 的吸附行為符合Langmuir 模型，表明聚合物層對PEOA 的吸附是單分子層吸附。

表2 Langmuir 與Freundlich 模型的等溫吸附參數(shù)Table 2 Adsorption isotherm constants for Langmuir and Freundlich equations

2.3.2 吸附動力學(xué)實驗

為了研究PEOA-MIPs 達(dá)到吸附平衡所需的時間和吸附速率，PEOA-MIPs 和PEOA-NIPs 吸附動力學(xué)曲線見圖6b。PEOA-MIPs 對青霉噻唑酸的吸附量在短時間內(nèi)有很大的增加，在45 min 時吸附量變化趨于平緩，達(dá)到吸附平衡；且在任何時間段PEOA-MIPs 的吸附量均明顯高于PEOA-NIPs。說明能與模板分子相互匹配且?guī)в凶R別位點(diǎn)的三維空穴大都存在于聚合物的表面，因此可以快速地吸附目標(biāo)化合物。

用準(zhǔn)一級動力學(xué)方程和準(zhǔn)二級動力學(xué)方程進(jìn)行吸附動力學(xué)分析，結(jié)果見表3。準(zhǔn)二級動力學(xué)方程的相關(guān)系數(shù)（R2）優(yōu)于準(zhǔn)一級動力學(xué)方程，聚合物對PEOA 的吸附動力學(xué)符合準(zhǔn)二級動力學(xué)方程，表明PEOA-MIPs 吸附識別過程主要為化學(xué)吸附，PEOA-MIPs 具有快速的傳質(zhì)速率和結(jié)合動力學(xué)的特點(diǎn)。

表3 準(zhǔn)一級和準(zhǔn)二級模型的動力學(xué)參數(shù)Table 3 Kinetic constants for pseudo-first-order rate and pseudo-second-order rate equations

圖6 PEOA-MIPs 和PEOA-NIPs 的（a）等溫吸附曲線、（b）吸附動力學(xué)曲線和（c）聚合物層的等溫吸附曲線Fig.6 （a）Adsorption isotherms，（b）kinetics of PEOA-MIPs，PEOA-NIPs and （c）adsorption isotherms of polymer layers

2.3.3 吸附選擇性實驗

為考察PEOA-MIPs 對模板分子的選擇性識別能力，選擇6-氨基青霉烷酸、青霉素G、美洛西林、氯唑西林和奧拉西坦作為類似物進(jìn)行吸附選擇性實驗，其化學(xué)結(jié)構(gòu)和聚合物對其的吸附選擇性結(jié)果見圖7。PEOA-MIPs 對青霉噻唑酸的吸附能力最強(qiáng)，印跡因子為6.3，6-氨基青霉烷酸、青霉素G、美洛西林、氯唑西林和奧拉西坦的印跡因子分別為2.5、1.8、4.1、1.8 和1.0。在聚合物制備過程中，模板分子PEOA 在硅膠表面留下與PEOA 空間結(jié)構(gòu)相匹配且具有特異識別位點(diǎn)的三維孔穴，因此對于非結(jié)構(gòu)類似物奧拉西坦的吸附量很少，且無特異性吸附。對于6-氨基青霉烷酸、青霉素G、美洛西林和氯唑西林，結(jié)構(gòu)上與青霉噻唑酸類似，存在可與PEOAMIPs 相互作用的位點(diǎn)，但空間結(jié)構(gòu)的差異影響了聚合物的吸附能力，因此PEOA-MIPs 對其的吸附量較低，印跡因子也低于青霉噻唑酸。表明PEOAMIPs 對模板分子有高度的選擇性和識別能力。

2.4 聚合方法的比較

將所得硅膠表面分子印跡聚合物與文獻(xiàn)報道采用表面分子印跡聚合法所得的聚合物進(jìn)行比較。Wei 等［25］采用溶膠-凝膠技術(shù)制備了對咖啡因具有特異識別能力的表面分子印跡聚合物，飽和吸附量為3.88 mg／g，該法制備條件溫和，操作簡便，但在制備過程中凝膠化的程度不易控制，溶膠-凝膠印跡層易發(fā)生收縮和干裂，導(dǎo)致部分結(jié)合位點(diǎn)被破壞，因此該法制備的聚合物存在對目標(biāo)分子吸附容量低的問題，且該法制備過程耗時較長（72 h）。Li 等［26］采用表面印跡犧牲載體法制備了對鹽酸小檗堿具有特異識別能力的分子印跡聚合物，所制備的顆粒形狀規(guī)整，多孔性好，但當(dāng)載體硅膠用氫氟酸除去后，導(dǎo)致聚合物機(jī)械穩(wěn)定性和抗壓性差，不宜用作色譜填料或固相萃取介質(zhì)，且制備過程繁瑣。本文利用硅膠表面的羥基基團(tuán)，以APTES 修飾硅膠，從而將聚合物層嫁接在硅膠表面，操作簡便，耗時較短（24 h），接枝聚合法增大了聚合物層結(jié)合位點(diǎn)的可接近性，使其具有更好的吸附特性，且具有機(jī)械穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)。

2.5 樣品分析

由于分子印跡聚合物對模板分子具有特異性吸附能力，因此常與固相萃取技術(shù)結(jié)合來實現(xiàn)對目標(biāo)物質(zhì)的富集、分離和純化。本文將制備的PEOAMIPs 應(yīng)用于固相萃取介質(zhì)，制備了分子印跡固相萃取小柱，并與HPLC 結(jié)合，應(yīng)用于豬肝中青霉噻唑酸的分離和分析。經(jīng)過MISPE 凈化前后樣品的HPLC 色譜圖見圖8。經(jīng)過MISPE 凈化后豬肝中內(nèi)源性雜質(zhì)明顯減少，表明MISPE 預(yù)處理可以有效地消除樣品中雜質(zhì)的干擾，實現(xiàn)對樣品中PEOA 的富集和純化。豬肝樣品中PEOA 加標(biāo)回收率測定結(jié)果見表4。PEOA 的回收率為87.2% ～92.3%，RSD 均小于7.9%，表明該法可用于實際樣品中微量PEOA 的富集、分離和分析。

圖7 PEOA 及其類似物的（a）化學(xué)結(jié)構(gòu)和（b）PEOA-MIPs 對PEOA 及其類似物的吸附選擇性Fig.7 （a）Chemical structures of PEOA and its analogues and （b）adsorption selectivity of PEOA-MIPs for PEOA and its analogues

圖8 加標(biāo)豬肝樣品的色譜圖Fig.8 Chromatograms of spiked pork liver samples

表4 豬肝樣品中PEOA 的回收率（n＝3）Table 4 Recoveries of PEOA in pork liver samples （n＝3）

3 結(jié)論

以青霉素中致敏性雜質(zhì)青霉噻唑酸為模板分子，采用表面分子印跡聚合法制備了PEOA-MIPs，并對制備條件進(jìn)行了優(yōu)化。通過SEM、FT-IR、TGA和元素分析結(jié)果顯示聚合物層已成功接枝在硅膠表面，并具有良好的熱穩(wěn)定性。吸附性能研究發(fā)現(xiàn)PEOA-MIPs 對PEOA 具有良好的吸附性能和特異選擇識別能力，靜態(tài)吸附符合Langmuir 方程，其飽和吸附量為122.78 mg／g，并可在45 min 內(nèi)達(dá)到吸附平衡，且吸附速率符合準(zhǔn)二級動力學(xué)方程，PEOAMIPs 對目標(biāo)物的吸附是以化學(xué)吸附為主的單分子層吸附。所制備的PEOA-MIPs 具有更大的吸附量、更快的吸附速率和更好的識別能力，并用于萃取介質(zhì)，結(jié)合液相色譜技術(shù)實現(xiàn)豬肝中青霉噻唑酸的富集和分析，對于提高青霉素類藥物的安全性和控制食品的質(zhì)量具有重要意義。

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